逐級pH敏感雙方法載多柔比星納米粒的構(gòu)建及共遞送基因的初步評價.pdf

1、化學治療（化療）是癌癥治療中最為常用的治療手段。然而傳統(tǒng)化療在臨床應用中常出現(xiàn)療效較差、毒副作用過大等問題。如何實現(xiàn)藥物的有效遞送和可控釋放，從而提高化療治療效果、降低毒副作用是癌癥治療中亟待解決的問題。
　　化療與基因治療聯(lián)合治療，是提高腫瘤化療效果、減輕毒副作用的一種常用治療手段。將化療藥物與基因裝載于同一載體中，有利于實現(xiàn)兩者生物藥劑學性質(zhì)同步化，確保化療藥物與基因以合適比例遞送至同一靶細胞?；熍c基因治療聯(lián)合治療的研究一直

2、是癌癥聯(lián)合治療研究領域的熱點和難點。
　　近年來，納米載藥系統(tǒng)在癌癥治療領域具有廣泛應用。與傳統(tǒng)小分子化療藥物相比，納米載藥系統(tǒng)可通過高通透性和滯留(enhanced permeability and retentioneffect, EPR)效應被動靶向于腫瘤組織，可改善藥物體內(nèi)無選擇性分布，提高腫瘤組織局部藥物濃度，有利于提高抗腫瘤效果、減輕毒副作用。同時，納米載藥系統(tǒng)可將化療藥物與基因裝載于同一載體，在聯(lián)合治療研究領域占有重

3、要地位。
　　納米載藥系統(tǒng)通過EPR效應富集于腫瘤組織后，還需進一步實現(xiàn)藥物可控釋放，方可發(fā)揮最佳藥效。基于由生理環(huán)境(pH7.4)到腫瘤微環(huán)境（約pH6.5）再到腫瘤細胞內(nèi)吞體/溶酶體（約pH5.0）pH的逐級降低，構(gòu)建具有殼核結(jié)構(gòu)的逐級pH敏感納米載藥系統(tǒng)，在藥物可控遞送領域具有巨大應用潛力。殼核結(jié)構(gòu)逐級pH敏感納米載藥系統(tǒng)的設計理念為:在正常生理組織及血液循環(huán)中，負電性外殼的包裹可使納米載藥系統(tǒng)維持穩(wěn)定，有利于延長循環(huán)時間，

4、避免藥物提前泄露導致對正常生理組織產(chǎn)生毒性;到達腫瘤組織后，腫瘤微酸性環(huán)境中，負電性外殼脫落，暴露出的正電性內(nèi)核易被腫瘤細胞攝取入胞;入胞后的納米載藥系統(tǒng)在內(nèi)吞體/溶酶體酸性環(huán)境中，進一步pH敏感釋放藥物，發(fā)揮抗腫瘤效果。第一重/腫瘤微環(huán)境pH敏感聯(lián)合第二重/細胞內(nèi)pH敏感的逐級pH敏感策略，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物的腫瘤細胞內(nèi)精準釋放，提高抗腫瘤效果、減輕毒副作用。
　　納米載藥系統(tǒng)的高載藥量是發(fā)揮治療效果的基礎。雙方法載藥是提高納米載藥系

5、統(tǒng)中藥物裝載量的常用方法。物理裝載聯(lián)合化學連接的雙方法載藥策略可彌補單一方法載藥的不足，提高抗腫瘤效果。
　　基于上述設計理念，本課題采用雙方法載藥策略聯(lián)合逐級pH敏感策略構(gòu)建了逐級pH敏感雙方法載鹽酸多柔比星(doxorubicin hydrochloride，DOX)納米粒。即，首先合成pH敏感腙鍵連接的聚乙烯亞胺-多柔比星結(jié)合物(PEI-C-DOX)，隨后選擇21個堿基對的寡聚核苷酸（CGA-ODNs）作為物理裝載DOX的載

6、體，經(jīng)室溫孵育獲得載DOX的CGA-ODNs(OD)，PEI-C-DOX壓縮OD得到化學連接聯(lián)合物理裝載的雙方法載DOX復合物PEI-C-DOX/OD(POD)。以pH敏感兩親性聚電解質(zhì)羧甲基殼聚糖（O-carboxymethyl-chitosan，CMCS）作為外殼材料包裹POD，得到逐級pH敏感雙方法載DOX納米粒CMCS/POD(CPOD)。
　　在上述研究基礎上，本課題進一步采用一步共裝載策略構(gòu)建了DOX與pDNA共遞送納

7、米粒。即，選擇增強型綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA(enhanced greenfluoresycent protein，pEGFP)作為模型基因，PEI-C-DOX壓縮OD與pEGFP混合物可實現(xiàn)藥物與基因一步共裝載，得到共遞送復合物PEI-C-DOX/OD&pEGFP(PODE)，PODE外層包裹CMCS得到共遞送納米粒CMCS/PODE(CPODE)。CPODE同樣具有逐級pH敏感性，并為今后的化療與基因治療聯(lián)合治療奠定了基礎。
　

8、　主要研究方法和結(jié)果如下:
　　1.DOX含量測定方法建立
　　本章運用紫外分光光度法建立DOX體外含量測定方法，結(jié)果表明DOX在5-35μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.9994)，低、中、高濃度日內(nèi)、日間精密度及方法回收率符合測定要求。運用熒光分光光度法建立DOX不同pH條件下體外含量測定方法，結(jié)果表明，pH7.4條件下DOX在51-1020 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.9995)，低、中、高濃度日內(nèi)、日間

9、精密度及方法回收率符合測定要求，pH5.0條件下DOX在50-1000 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好(r=0.9993)，低、中、高濃度日內(nèi)、日間精密度及方法回收率符合測定要求。
　　2.逐級pH敏感載DOX納米粒的構(gòu)建及其理化性質(zhì)初步評價
　　本章首先合成PEI-C-DOX，1H-NMR及IR驗證其結(jié)構(gòu)。室溫孵育制備OD，熒光光譜掃描確定其最優(yōu)裝載比例為0.12∶1。對OD進行初步穩(wěn)定性考察，結(jié)果表明，4℃條件下，24h內(nèi)

10、DOX無明顯釋放，OD穩(wěn)定性較好。采用靜電自組裝的方式分別構(gòu)建POD及CPOD，通過瓊脂糖凝膠電泳分析及理化性質(zhì)初步評價對POD和CPOD分別進行處方篩選，確定最優(yōu)處方。POD最優(yōu)處方為PEI與CGA-ODNs質(zhì)量比339∶64，CPOD最優(yōu)處方為CMCS與CGA-ODNs質(zhì)量比75∶4。最優(yōu)處方POD及CPOD均微觀形態(tài)圓整，粒徑分布較為均勻。POD平均粒徑(140.2±5.2) nm，PDI0.144±0.018，zeta電位(20

11、.4±1.9) mV。CPOD平均粒徑(165.0±3.3) nm，PDI0.191±0.001，zeta電位-(15.6±0.82) mV。血漿穩(wěn)定性實驗表明，在10％血漿中，POD穩(wěn)定性較差，CPOD可在24 h內(nèi)保持粒徑穩(wěn)定。溶血實驗表明CPOD在實驗濃度范圍內(nèi)未出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，溶血百分率均小于5％，安全性較好。
　　3.CPOD逐級pH敏感性評價及體內(nèi)外抗腫瘤效果初步評價。
　　CMCS體外pH敏感脫落實驗結(jié)果表明，腫

12、瘤微酸性pH條件下，CMCS可發(fā)生電荷翻轉(zhuǎn)并從CPOD表面脫落。在B16及HepG2兩種細胞系中，流式細胞分析結(jié)果表明，pH6.5及pH6.0條件下CPOD的攝取率均明顯高于pH7.4(B16p＜0.005，HepG2 p＜0.01)，驗證了CPOD第一重/腫瘤微環(huán)境pH敏感性。體外釋放實驗表明，48 h，pH5.O條件下CPOD累積釋放量明顯多于pH7.4條件下(p＜0.005)。pH敏感入核實驗結(jié)果表明，在B16及HepG2兩種細胞

13、系中，pH6.5及pH6.0條件下CPOD可入胞，并釋放DOX，4h時釋放的DOX已基本完全入核，驗證了CPOD第二重/胞內(nèi)pH敏感性。MTT實驗結(jié)果表明，B16細胞系中，游離DOX細胞毒性強于CPOD; HepG2細胞系中，CPOD細胞毒性與DOX相當。實驗濃度范圍內(nèi)，空白納米載體在兩種細胞系中均未表現(xiàn)出明顯細胞毒性，安全性較好。實時近紅外小動物活體成像結(jié)果表明，CPOD自小鼠靜脈注射給藥1h時開始富集于腫瘤部位，并持續(xù)至24 h。2

14、4 h，CPOD組離體腫瘤熒光強度是游離藥物組的3.46倍，驗證了CPOD腫瘤靶向性。荷瘤小鼠模型體內(nèi)抗腫瘤實驗結(jié)果表明，CPOD抑瘤效果優(yōu)于兩倍劑量游離藥物組（瘤體積p＜0.005，瘤重p＜0.05），且未導致小鼠體重減輕。組織切片實驗結(jié)果表明，CPOD未導致小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、腎）病變，體內(nèi)安全性較好。
　　4.DOX與pEGFP共遞送納米粒的構(gòu)建及初步評價
　　構(gòu)建DOX與pEGFP共遞送納米復合物PODE，

15、CMCS包裹PODE構(gòu)建CPODE，分別對其進行處方考察。PODE最優(yōu)處方為PEI與pEGFP質(zhì)量比68∶24，轉(zhuǎn)染效率為11.8±0.10％。CPODE最優(yōu)處方為CMCS與CGA-ODNs質(zhì)量比75∶8。最優(yōu)處方PODE及CPODE均微觀形態(tài)圓整，粒徑分布較為均勻，PODE平均粒徑為(77.61±5.7) nm，PDI為0.265±0.019，zeta電位為(4.63±0.33) mV。CPODE平均粒徑為(169.3±3.5) nm

16、，PDI為0.191±0.097，zeta電位為-（12.8±0.61）mV?？购怂崦改芰嶒灡砻鳎珻PODE抗核酸酶能力優(yōu)于PODE。血漿穩(wěn)定性實驗表明，CPODE血漿穩(wěn)定性較好，可保護pEGFP不被完全降解。CMCS的包裹可提高CPODE抗核酸酶能力和血漿穩(wěn)定性。CPODE程序性釋放實驗表明，DOX先行釋放，12 h累積釋放量為51.5％，pEGFP釋放需要超過12h或更長時間。CPODE共遞送行為考察結(jié)果表明，CPODE具有良好的