pH敏感逐級靶向納米載體的構(gòu)建及其用于遞送siRNA至M2型腫瘤相關巨噬細胞的研究.pdf

1、腫瘤免疫治療是指激發(fā)或調(diào)動機體的免疫系統(tǒng)，增強機體抗腫瘤免疫應答，從而控制和殺傷腫瘤免疫細胞，抑制腫瘤生長[1-3]。近年來，腫瘤免疫療法已發(fā)展成為繼手術治療、放射治療、化學療法之后的第四種腫瘤治療模式。大多數(shù)實體瘤微環(huán)境中都伴有腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)，它們與腫瘤的生成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關。TAMs可以分為M1和M2兩種表型。M1型TAMs可引起炎癥反應、激活免疫反應，具有

2、腫瘤抑制作用。M2型TAMs具有抗炎作用，且可促進血管生成和組織重塑，抑制免疫反應，促進腫瘤的生成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。
　　由于腫瘤細胞分泌白介素-10、集落刺激因子(Colony Stimulating Factor，CSF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子β（Transforming-Growth Factorβ，TGFβ）等，腫瘤部位大多數(shù)TAMs表現(xiàn)為M2表型。殺傷M2型TAMs或促進M2型TAMs向M1表型的轉(zhuǎn)化成為基于M2型TAMs腫瘤免

3、疫治療的有效手段。M2型TAMs成為腫瘤免疫治療的有效靶點。目前作用于M2型TAMs的藥物主要有單抗、小分子抑制劑和siRNA。其中，siRNA可以選擇性沉默靶基因，對基因進行高度、特異性的調(diào)控，且具有特異性調(diào)節(jié)巨噬細胞和細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路的潛能，可作用于M2型TAMs，發(fā)揮免疫療效。
　　目前，一些研究構(gòu)建樹狀大分子、陽離子聚合物、膠束等載體用于siRNA的遞送，這些載體將M2型TAMs的靶向因子修飾于載體表面，從而發(fā)揮主動靶向

4、作用。但是由于巨噬細胞分布范圍廣，將siRNA遞送至其他正常組織的M2型巨噬細胞，可能會引起免疫系統(tǒng)破壞等毒副作用。因此，設計一種載體以增加siRNA在M2型TAMs的積累，減少siRNA在正常組織的分布，具有十分重要的意義。本課題構(gòu)建pH敏感逐級靶向納米載體通過組織透過性增強及滯留效應（enhanced permeation and retention effect，EPR effect）和轉(zhuǎn)胞吞作用的雙重一級靶向作用，到達腫瘤組織，

5、增加納米載體在腫瘤部位的蓄積;pH敏感一級靶向材料在腫瘤部位脫落，暴露二級靶向內(nèi)核，靶向M2型TAMs，將siRNA特異性遞送至M2型TAMs。
　　本課題選擇靶向肽天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arginine，NGR)作為一級靶向因子，羧甲基殼聚糖（O-carboxymethyl-chitosan，CMCS）作為pH敏感材料，以聚乙二醇[poly(ethylene glycol),PEG]為

6、連接，合成pH敏感一級靶向材料CMCS-PEG-NGR(CPN);選取甘露糖作為二級靶向因子，聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PEI)作為基因壓縮材料，合成α-D吡喃甘露糖基苯基異硫氰酸酯（α-D-Mannopyranosylphenyl，MPITC）-PEI(M-PEI)作為二級靶向材料。M-PEI壓縮siRNA形成表面荷正電的二級靶向內(nèi)核M-PEI/siRNA(MPR)，通過靜電作用吸附在生理條件下(pH7.4)荷負電

7、的CPN，構(gòu)成pH敏感逐級靶向納米載體CPN/M-PEI/siRNA(CMPR)。本課題選取siR-RiboTMNegative Control作為模型基因制備PEI/siRNA(PR)、MPR、CPN/PEI/siRNA(CPR)和CMPR，篩選處方并對最優(yōu)處方進行理化性質(zhì)評價，考察其穩(wěn)定性、細胞攝取及分布，對CPN的pH敏感性進行驗證，考察MPR、CMPR的體內(nèi)靶向性，對PR、MPR、CPR、CMPR的體內(nèi)安全性進行初步評價。主要研

8、究方法和結(jié)果包括:
　　第一章一級靶向納米載體的構(gòu)建及其理化性質(zhì)研究
　　本章合成pH敏感一級靶向材料CPN，以siR-RiboTM Negative Control為模型基因，采用室溫孵育的方法制備PR及CPR。采用瓊脂糖凝膠電泳對PEI壓縮siRNA的能力及CPN靜電吸附形成CPR的情況進行考察，確定最優(yōu)處方;采用透射電鏡觀察PR、CPR的形態(tài)，Malvern粒度電位分析儀測定其粒徑、粒度分布及電位;最后采用瓊脂糖凝膠電

9、泳對PR、CPR抗RNase A能力及血清穩(wěn)定性進行考察。
　　實驗結(jié)果表明，CPN的核磁共振氫譜(Nuclear Magnetic Resonance，1H NMR)出現(xiàn)CMCS、PEG、NGR特征峰，確證CPN的成功合成;PR的最優(yōu)處方為PEI與siRNA質(zhì)量比為2∶1，CPR最優(yōu)處方為CPN與siRNA質(zhì)量比為4∶1，最優(yōu)處方工藝制備的PR和CPR形態(tài)較為圓整，均成球形或類球形，平均粒徑分別為83.7±4.9 nm和154.

10、5±2.1 nm，平均電位分別為20.97±1.53 mV和-14.10±0.90 mV，多分散系數(shù)均小于0.2;在12 h內(nèi)，PR、CPR對siRNA具有一定的保護能力，可以保護siRNA免受RNaseA的降解及血清成分的破壞。
　　第二章pH敏感逐級靶向納米載體的構(gòu)建及其理化性質(zhì)研究
　　本章合成二級靶向材料M-PEI，以siR-RiboTM Negative Control為模型基因，采用室溫孵育的方法制備MPR及CM

11、PR。采用瓊脂糖凝膠電泳對M-PEI壓縮siRNA的能力及CPN靜電吸附形成CMPR的情況進行考察，確定最優(yōu)處方;采用透射電鏡觀察MPR、CMPR的形態(tài)，Malvern粒度電位分析儀測定其粒徑、粒度分布及電位;采用瓊脂糖凝膠電泳對MPR、CMPR抗RNase A能力及血清穩(wěn)定性進行考察;采用Malvern粒度電位分析儀對MPR、CMPR的存儲穩(wěn)定性及血漿穩(wěn)定性進行考察;建立siRNA在不同pH PBS中的測定方法，采用動態(tài)膜透析法對si

12、RNA的釋放行為進行考察;采用酸堿滴定法測定CPN的等電點。
　　實驗結(jié)果表明，M-PEI的1H NMR圖譜出現(xiàn)MPITC、PEI的特征峰，確證M-PEI成功合成，傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，F(xiàn)TIR)進一步驗證M-PEI的合成;MPR的最優(yōu)處方為M-PEI與siRNA質(zhì)量比為2∶1，CMPR最優(yōu)處方為CPN與siRNA質(zhì)量比為4∶1，最優(yōu)處方工藝制備的MPR

13、和CMPR形態(tài)較為圓整，均成球形或類球形，平均粒徑分別為93.2±4.1 nm和146.4±6.9 nm，平均電位分別為16.40±0.92 mV和-17.00±0.10 mV，多分散系數(shù)均在0.2左右;在12h內(nèi)，MPR、CMPR對siRNA具有一定的保護能力，可以保護siRNA免受RNaseA的降解及血清成分的破壞，在血漿中CMPR比MPR具有更高的穩(wěn)定性;體外釋放結(jié)果顯示在pH5.0和pH6.5條件下 siRNA從CMPR中的累計

14、釋放量顯著高于pH7.4條件，siRNA從CMPR中的釋放具有一定的pH敏感性;CPN的等電點為6.33。
　　第三章pH敏感逐級靶向納米載體的體內(nèi)、外靶向性評價及初步安全性評價
　　本章以F4/80抗體標記巨噬細胞，以CD206抗體標記M2型TAMs，以Cy3和Cy5標記的siR-RiboTM Negative Control作為模型基因，對PR及MPR的細胞攝取進行考察。采用激光共聚焦顯微鏡對PR、MPR在小鼠腹腔巨噬細

15、胞上的攝取進行觀察和定量，對siRNA及CD206進行共定位及定量分析;對MPR在小鼠腹腔巨噬細胞上的競爭性攝取進行觀察和定量分析;對CMPR在pH6.5、pH7.4培養(yǎng)基條件下的攝取進行觀察和定量分析;采用小鼠活體成像的方法對CMPR在小鼠的體內(nèi)分布進行觀察和定量分析;采用免疫熒光技術觀察小鼠腫瘤組織冰凍切片，對PR、MPR、CMPR在腫瘤組織中的細胞攝取情況進行考察;采用溶血實驗對PR、MPR、CPR、CMPR的溶血情況進行考察;最

16、后對給藥小鼠組織進行HE染色評價PR、MPR、CPR和CMPR的初步安全性。
　　細胞攝取實驗結(jié)果顯示，細胞與PR、MPR孵育1h、4h后，M2型TAMs對PR、MPR的攝取無明顯差異(p＞0.1);競爭性抑制實驗結(jié)果顯示，在未經(jīng)游離甘露糖孵育的細胞內(nèi)，細胞與MPR孵育1h后，siRNA與CD206的共定位效率為事先與游離甘露糖孵育細胞中共定位效率的1.63倍，存在一定差異(p＜0.05)，表明MPR可通過M2型TAMs表面CD2

17、06受體介導的內(nèi)吞途徑入胞，細胞與MPR孵育4h后，二者共定位效率無明顯差異(p＞0.3);在pH6.5條件下，siRNA與CD206共定位效率為pH7.4條件下的1.40倍，存在顯著差異(p＜0.01)，表明CPN可在pH6.5條件下響應性脫落;小鼠活體成像結(jié)果顯示，CMPR組在腫瘤組織的平均熒光強度是游離siRNA組的4.65倍，表明CMPR可增加siRNA在腫瘤組織的蓄積;腫瘤組織冰凍切片實驗結(jié)果表明CMPR可增加siRNA在M2

18、型TAMs中的蓄積，MPR可特異性靶向M2型TAMs;溶血實驗結(jié)果顯示，PR、MPR、CPR、CMPR均不會引起溶血現(xiàn)象，可靜脈注射;小鼠給予PR、MPR、CPR、CMPR后，對小鼠組織進行HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，各組織器官與生理鹽水組比較無顯著差異，無明顯病理變化。上述實驗結(jié)果表明，CMPR可增加siRNA在腫瘤組織的蓄積，CPN可在腫瘤組織微酸性條件下響應性脫落，MPR可通過M2型TAMs表面CD206受體介導的內(nèi)吞途徑入胞。PR、MPR