多柔比星載體紅細(xì)胞磁化技術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生存和健康，其治療手段主要是手術(shù)切除后，聯(lián)合化療，放療和免疫治療等。由于化療藥物的非選擇性，對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生作用的同時(shí)也對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生較強(qiáng)的毒副作用，導(dǎo)致化療效果不佳。制備應(yīng)用良好生物相容和靶向性的抗腫瘤藥物載體，通過(guò)定位的緩釋作用，繼能減少藥物使用量，又能提高局部藥物濃度，達(dá)到減輕全身毒副作用，是提高腫瘤化療效果的發(fā)展方向。紅細(xì)胞作為抗癌藥物多柔比星(Doxorubicin，DOX)載體可減少用藥量和提高療效，但其

2、靶向性差。設(shè)想用紅細(xì)胞雙載DOX和納米級(jí)Fe3O4磁流體(Fe3O4 nano-magnetic ferrofluid，MF)，借助于外加磁場(chǎng)以解決DOX紅細(xì)胞載體的靶向問(wèn)題。電穿孔法制備細(xì)胞藥物載體具有較高的效率包載率。建立電穿孔制備磁化載體紅細(xì)胞的方法，探討磁流體磁化紅細(xì)胞及相關(guān)載體制備最佳實(shí)驗(yàn)條件及分離與鑒定方法，觀察和分析磁化紅細(xì)胞(即單載MF紅細(xì)胞，MF載體紅細(xì)胞)的磁化現(xiàn)象及磁化DOX載體紅細(xì)胞(即雙載DOX及MF紅細(xì)胞)的

3、磁化率及載藥參數(shù)，體外相關(guān)生物學(xué)和物理學(xué)特性，比較雙載磁化DOX紅細(xì)胞和單載磁化紅細(xì)胞的磁化率，為紅細(xì)胞靶向治療腫瘤提供實(shí)驗(yàn)方法，為進(jìn)一步應(yīng)用性研究積累實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。 一、磁化紅細(xì)胞制備的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究 (一)方法 1、選擇最佳實(shí)驗(yàn)條件：通過(guò)對(duì)不同粒徑顆粒磁流體的分散性和其性質(zhì)篩選比較，選擇合適大小和易于觀察的磁流體，建立電穿孔法制備制備MF載體紅細(xì)胞：研究MF濃度與磁響應(yīng)性關(guān)系、RBC與MF的比例、不同電壓，脈寬，電

4、擊頻率，電場(chǎng)強(qiáng)度，熱孵對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響、比較優(yōu)化載體制備條件。 2、選擇最佳分離條件：比較不同的離心轉(zhuǎn)速和時(shí)間，選擇將未載入紅細(xì)胞的磁流體從反應(yīng)體系中移除的最適方法。 3、選擇合適的鑒定方法：比較涂片技巧、磁化紅細(xì)胞終產(chǎn)物在普通顯微鏡、熒光顯微鏡，染色、電鏡觀察等方法，選擇鑒定紅細(xì)胞是否已被磁化的適合檢測(cè)方法。 4、選擇合適的磁流體：比較兩種不同修飾劑的磁流體的分散性和磁流體特性，選擇符合磁化紅細(xì)胞條件的磁流體。

5、 5、以自動(dòng)細(xì)胞分析儀測(cè)定全血、洗滌和載體紅細(xì)胞的數(shù)量、平均容積(MCV)、平均血紅蛋白含量(MCHC)等指標(biāo)，考察載體紅細(xì)胞回收率等載藥參數(shù)及生理特性的變化情況。比較磁化紅細(xì)胞的貯存穩(wěn)定性。 (二)結(jié)果 1、帶有熒光標(biāo)記的磁流體fluidMAG-D和fluidMAG-DP，直徑100nm，為最佳實(shí)驗(yàn)磁化材料，500V，100μs，10P(電場(chǎng)強(qiáng)度為2.5KV/cm)為電穿孔法最佳實(shí)驗(yàn)條件。紅細(xì)胞濃度為109/m

6、l，磁流體濃度為15μg/ml，紅細(xì)胞和MF的比例為1：1，37℃熱孵30min可以增加紅細(xì)胞的穩(wěn)定性。 2、通過(guò)低速離心800轉(zhuǎn)5分鐘的方法分離去除未包載入紅細(xì)胞的磁流體。 3、通過(guò)質(zhì)控方法的改進(jìn)、觀察實(shí)驗(yàn)終產(chǎn)物直接涂片、熒光顯微鏡、透射電鏡等方法證明紅細(xì)胞已被磁化。 4、選擇帶熒光標(biāo)記的fluidMAG-D和fluidMAG-DP作為磁化劑，便于觀察和定量測(cè)定。 5、磁化紅細(xì)胞回收率為(67.50±4

7、.55)％，MCV減小(4.00±1.06)％，血紅蛋白含量減少(18.12±3.27)％。磁化紅細(xì)胞穩(wěn)定貯存可達(dá)5天。 二、磁化DOX載體紅細(xì)胞制備的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)研究 (一)方法 1、比較不同濃度DOX對(duì)電穿孔法制備磁化DOX載體紅細(xì)胞的影響，摸索建立制備磁化DOX載體紅細(xì)胞的最佳方法并優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。 2、HPLC法測(cè)定磁化紅細(xì)胞內(nèi)外DOX的含量，初步確定DOX的包載率。自動(dòng)細(xì)胞分析儀測(cè)定載體紅細(xì)胞的數(shù)量、

8、平均容積(MCV)等指標(biāo)，比較DOX濃度與平均血紅蛋白含量(MCHC)、載體紅細(xì)胞回收率之間的關(guān)系并考察生理特性的變化情況。比較磁化紅細(xì)胞的貯存穩(wěn)定性。 3、FCM分析磁化DOX紅細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度，以半定量確定紅細(xì)胞的磁化率。 (二)結(jié)果 1、以電穿孔法同時(shí)包載DOX、MF，紅細(xì)胞濃度為109/ml，磁流體濃度為15μg/ml，DOX濃度為2mg/ml，體積比為1：1：1，電穿孔后37℃孵育30分鐘。此條件為制

9、備磁化DOX載體紅細(xì)胞的最佳方法。 2、當(dāng)紅細(xì)胞、DOX、MF三者比例1：1：1、包載效果最好。通過(guò)低速離心法分離未包載入紅細(xì)胞的磁流體。直接涂片、熒光顯微鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞檢測(cè)等方法證明紅細(xì)胞已被磁化。 3、磁化DOX紅細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度為19±5.8，高于單載DOX紅細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度12±4.6，磁化效果顯著。 (三)結(jié)論 1、以電穿孔法和適合的磁流體品種制備磁化紅細(xì)胞可行，載藥參數(shù)良好，載體紅

10、細(xì)胞生理特性無(wú)明顯改變，為進(jìn)一步探討紅細(xì)胞靶向治療腫瘤提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 2、以電穿孔法同時(shí)包載DOX、MF制備MF+DOX載體紅細(xì)胞可行，實(shí)驗(yàn)條件與單載MF紅細(xì)胞制備條件基本一致，紅細(xì)胞濃度為109/ml，磁流體濃度為15ug/ml，BOX濃度為2mg/ml，紅細(xì)胞、DOX、MF三者體積比例1：1：1時(shí)是最佳濃度配比。雙載紅細(xì)胞與磁化紅細(xì)胞回收率及生理特性無(wú)明顯改變，紅細(xì)胞能夠作為抗癌藥靶向治療腫瘤的載體。 3、雙載

11、紅細(xì)胞MCV減小(6.20±2.31)％，血紅蛋白含量減少(25.04±4.55)％，載體紅細(xì)胞回收率(59.16±6.15)％。磁化DOX載體紅細(xì)胞在PBS中穩(wěn)定貯存可達(dá)4天。雙載紅細(xì)胞MCV、穩(wěn)定貯存時(shí)間與磁化紅細(xì)胞無(wú)明顯差異。 三、比較單載磁化紅細(xì)胞和磁化DOX載體紅細(xì)胞物理性能的實(shí)驗(yàn)研究 (一)目的 比較電穿孔法制備磁化紅細(xì)胞和磁化BOX雙載紅細(xì)胞的磁響應(yīng)性，判斷BOX對(duì)電穿孔法制備紅細(xì)胞載體的影響，為進(jìn)

12、一步改善電穿孔制備磁化紅細(xì)胞載體的磁化率研究提供理論依據(jù)，為臨床輸血靶向治療腫瘤提供一種新的思路和選擇。 (二)方法 提取第一遍洗滌上清液，和紅細(xì)胞破壞后離心所得上清液，HPLC測(cè)定DOX含量的方法，分析BOX載體紅細(xì)胞內(nèi)外的藥物濃度，同時(shí)觀察溶血情況，比較紅細(xì)胞的貯存穩(wěn)定性，使用VSM檢測(cè)磁化BOX載體紅細(xì)胞的磁滯度曲線，確定其具有磁相應(yīng)性。 采用流式細(xì)胞儀分析法，對(duì)以標(biāo)有黃綠色熒光的磁流體，磁化紅細(xì)胞的磁化B

13、OX雙載紅細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析比較。確定BOX對(duì)磁化紅細(xì)胞的影響。 (三)結(jié)果 BOX載體紅細(xì)胞的體外特性紅細(xì)胞平均容積沒(méi)有明顯變化，血紅蛋白含量減少(25±7.66)％，前2小時(shí)藥物釋放為(15.64±1.13)％，隨時(shí)間延長(zhǎng)，釋放率加大，貯存穩(wěn)定可達(dá)4天。 VSM檢測(cè)磁化DOX紅細(xì)胞表明，紅細(xì)胞成功報(bào)載了磁流體，具有鐵磁性物質(zhì)所具有的磁滯現(xiàn)象，在改變磁場(chǎng)強(qiáng)度大小與方向的情況下，形成一條封閉的磁滯曲線

14、。在不同大小與方向的磁場(chǎng)下，磁化載體紅細(xì)胞具有不同的磁化強(qiáng)度，充分表明磁化DOX載體紅細(xì)胞在體外具有一定的磁響應(yīng)性。 FCM結(jié)果同樣證實(shí)紅細(xì)胞被成功磁化。雙載DOX磁化紅細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度比單載磁化紅細(xì)胞高(26.3±7.89％)，單載磁化紅細(xì)胞、雙載DOX磁化紅細(xì)胞組與未載藥和磁化組相比差異均顯著。 (四)結(jié)論 DOX載體紅細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)濃度約為細(xì)胞外濃度的兩倍，細(xì)胞載藥參數(shù)良好，載藥量較高。普通顯微鏡下觀察，