氟西汀通過對(duì)鈉氫交換體1的刺激誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞胞液的堿化及對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的探究.pdf

1、目的：
　　重癥抑郁往往出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞異常，而應(yīng)用抗精神病藥物治療可調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞功能。星形膠質(zhì)細(xì)胞通過對(duì)氫離子（通過鈉氫交換體1，NHE1，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT1/2和質(zhì)子乳酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MCT1）和碳酸氫根（通過碳酸氫鈉協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NBC或C1-/HCO3-轉(zhuǎn)運(yùn)體AE）轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)來維持大腦pH值穩(wěn)定。我們的研究表明，氟西汀的慢性作用使星形膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)pHi值增高，這一作用是通過刺激NHE1調(diào)節(jié)的氫離子的釋放來實(shí)現(xiàn)的。

2、>　　方法：
　　1、穩(wěn)態(tài)pHi檢測選取培養(yǎng)于蓋玻片的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，10μM氟西汀慢性處理3天后或者1μM氟西汀慢性處理1周、2周、3周和4周后，采用熒光探針技術(shù)檢測細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的pHi。
　　2、免疫沉淀選取培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿中的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，用10μM氟西汀急性處理30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘和1μM氟西汀急性處理20分鐘后，應(yīng)用免疫沉淀技術(shù)，檢測NHE1的磷酸化水平。
　　

3、3、Western Blot①選取培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，用0.1μM、0.5μM、1μM和10μM氟西汀急性處理20分鐘后，進(jìn)行Western blot，采用p-ERK1/2特異性抗體來檢測ERK1/2的磷酸化水平。在部分細(xì)胞中加入10μMU0126(MEK抑制劑)，25μM LY294002(PI3K抑制劑)或10μM Triciribine(AKT抑制劑)，觀察其是否可以抑制氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化

4、水平的作用。②選取培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，用0.1μM、0.5μM、1μM和10μM氟西汀急性處理20分鐘后，進(jìn)行Western blot，采用p-AKT特異性抗體來檢測p-AKT的磷酸化水平。在部分細(xì)胞中加入10μM U0126（MEK抑制劑）或25μM LY294002（PI3K抑制劑）觀察其是否可以抑制氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)AKT磷酸化水平的作用。③選取培養(yǎng)于60mm培養(yǎng)皿中的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞，用1μM和10μM氟

5、西汀急性處理20分鐘后，收集細(xì)胞。進(jìn)行Western blot，采用p-RSK特異性抗體來檢測RSK的磷酸化水平，在部分細(xì)胞中加入10μμM U0126（MEK抑制劑）或25μM LY294002(PI3K抑制劑)觀察其是否可以抑制氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)RSK磷酸化水平的作用。
　　4、酸負(fù)載20 mM NH4Cl處理星形膠質(zhì)細(xì)胞2分鐘后，檢測pHi恢復(fù)前兩分鐘pHi的變化速率(ΔpHi/Δt)。選取培養(yǎng)于蓋玻片的成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞

6、，用1μM和10μM氟西汀急性處理20分鐘后，應(yīng)用熒光探針技術(shù)檢測細(xì)胞NHE1活性。在部分細(xì)胞中加入200 nM SB204741(5HT2B受體拮抗劑)，10μM U0126（MEK抑制劑）或25μM LY294002（PI3K抑制劑）觀察其是否可以抑制氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)NHE1活性的作用。
　　結(jié)果：
　　1、穩(wěn)態(tài)pHi檢測與對(duì)照組相比，用10μM氟西汀慢性處理3天后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的pHi升高。用10μM氟西汀慢性處

7、理（1周、2周、3周和4周）后，星形膠質(zhì)細(xì)胞的pHi逐漸升高，在3周和4周時(shí)最明顯。
　　2、免疫沉淀10μM氟西汀急性處理30秒、1分鐘、5分鐘、10分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘，細(xì)胞內(nèi)p-NHE1逐漸升高，在20分鐘和40分鐘時(shí)最明顯，60分鐘時(shí)下降。1μM氟西汀急性作用20分鐘細(xì)胞內(nèi)p-NHE1升高。
　　3、Western Blot①0.1μM、0.5μM、1μM和10μM氟西汀急性處理20分鐘后，細(xì)胞內(nèi)p-E

8、RK1/2逐漸升高，10μM U0126(MEK抑制劑)、25μM LY294002（PI3K抑制劑）和10μM Triciribine(AKT抑制劑)都能抑制此作用。②0.1μM、0.5μM、1μM和10μM氟西汀急性作用20分鐘，細(xì)胞內(nèi)p-AKT逐漸升高，10μM U0126（MEK抑制劑）和25μM LY294002(PI3K抑制劑)都能抑制此作用。③1μM和10μM氟西汀急性處理20分鐘，細(xì)胞內(nèi)p-RSK逐漸升高，10μM U0

9、126（MEK抑制劑）和25μM LY294002（PI3K抑制劑）都能抑制此作用。
　　4、酸負(fù)載0.1μM、0.5μM、1μM和10μM氟西汀急性處理20分鐘后，細(xì)胞內(nèi)NHE1活性逐漸增強(qiáng)。200 nM SB204741(5HT2B受體拮抗劑)、10μMU0126(MEK抑制劑)、25μM LY294002(PI3K抑制劑)均能抑制此作用。
　　討論：
　　維持氫離子的穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外pH值的穩(wěn)定對(duì)于神經(jīng)元和腦

10、的功能是非常重要的。腦內(nèi)pH值的降低與腦內(nèi)病理?xiàng)l件的變化有關(guān)，例如缺血和癲癇。細(xì)胞外液的pH值受多種pH值的調(diào)節(jié)系統(tǒng)影響，這些調(diào)節(jié)系統(tǒng)位于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞上。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞通過酸負(fù)載，酸外排，碳酸氫鹽轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，在調(diào)節(jié)pH值間質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)pH值方面扮演了一個(gè)重要的角色。以前，我們?cè)鴪?bào)道，三種抗雙向情感障礙藥物慢性處理星形膠質(zhì)細(xì)胞可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)堿化。其中，鋰在細(xì)胞外通過對(duì)NHE1直接作用急劇地刺激氫離子的外排。然而，卡馬西平和丙戊酸上調(diào)了生電

11、的Na+/HCO3-共轉(zhuǎn)運(yùn)體NBCe1/SLC4A4的表達(dá)。在本篇論文中，我們系統(tǒng)地研究氟西汀在星形膠質(zhì)細(xì)胞中對(duì)pH值調(diào)節(jié)的影響和相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，包括氟西汀對(duì)pHi，NHE1磷酸化水平，MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT信號(hào)通路間的相互作用及NHE1活性的影響。
　　正如所預(yù)料的一樣，氟西汀的急性作用使NHE1和RSK磷酸化，表明RSK參與NHE1的磷酸化。雖然RSK在MAPK/ERK1/2的下游，但是此作用被MAPK

12、/ERK1/2或PI3K/AKT這兩條信號(hào)通路所抑制，這顯示出了這兩條通路的相互作用。NHE1活性被MAPK/ERK1/2、 PI3K/AKT或5-HT2B受體抑制劑所抑制，這顯示出氟西汀對(duì)NHE1的刺激受5-HT2B受體調(diào)節(jié)。在課題組以前的論文中，我們報(bào)道了在星形膠質(zhì)細(xì)胞上氟西汀充當(dāng)了5-HT2B受體的激動(dòng)劑。5-HT2受體的三種亞型，5-HT2A，5-HT2B和5-HT2C受體都是Gq/11蛋白偶聯(lián)受體，并且對(duì)這些受體的刺激激活了磷

13、脂酶C，因此產(chǎn)生了DAG和InsP3。由氟西汀作用于5-HT2B受體引起的ERK1/2磷酸化和上皮生長因子磷酸化的作用能被下列抑制劑所抑制(1)AG1478，EGFR酪氨酸激酶抑制劑(2) GM6001，Zn2+活化的金屬蛋白酶抑制劑，提示氟西汀可引起EGFR間接激活。
　　氟西汀也在星形膠質(zhì)細(xì)胞上通過EGFR的間接激活刺激了PI3K/AKT信號(hào)通路。RSK是ERK1/2的下游的效應(yīng)器。RSK屬于高保護(hù)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，這

14、些激酶參與到許多細(xì)胞活動(dòng)，并且也是一種NHE-1的激酶。
　　我們發(fā)現(xiàn)在臨床相關(guān)濃度下，氟西汀能誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2和AKT的磷酸化。理論上講，雖然PI3K/AKT、Raf/MAPK/ERK1/2是兩條平行的信號(hào)通路，但在PI3K/AKT、Raf/MAPK/ERK1/2級(jí)聯(lián)反應(yīng)間仍可發(fā)生相互作用，這些作用可能是正性調(diào)節(jié)，也可能是負(fù)性調(diào)節(jié)。在目前的工作中，我們發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT、Raf/MAPK/ERK1/2信號(hào)彼此加強(qiáng)。

15、在以往的研究中，我們發(fā)現(xiàn)氨作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后通過PI3K或AKT刺激Raf, MAPK或ERK1/2引起ERK1/2磷酸化，因?yàn)镋RK1/2磷酸化被MAK的抑制劑U0126和PI3K/AKT抑制劑LY294002所抑制。在其它研究中也能觀察到類似模式的相互作用，比如:(1)胰島素和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)作用于骨骼肌細(xì)胞或轉(zhuǎn)染的胰島素受體的中國倉鼠的卵母細(xì)胞。(2)血小板活化因子作用于豚鼠嗜中性粒細(xì)胞。(3)白介素-2作用于

16、T淋巴細(xì)胞(4)血小板源生長因子作用于纖維母細(xì)胞。雖然PI3K是Ras下游主要的信號(hào)之一，但也有證據(jù)顯示PI3K可在活化了Ras或其上游激活MAPK/ERK1/2通路。據(jù)我們所知，我們首次報(bào)道了MAPK/ERK1/2能夠增強(qiáng)PI3K/AKT信號(hào)通路。
　　氟西汀慢性處理星形膠質(zhì)細(xì)胞之后，pHi有所上升并且呈時(shí)間依賴性和濃度依賴性。這反映出穩(wěn)態(tài)pH值發(fā)生的變化可能會(huì)影響大腦pH值和星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能，并且可能與藥物的作用有關(guān)。pHi

17、的改變顯著地影響了星形膠質(zhì)細(xì)胞的生理機(jī)能，加入乳酸或者下調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞pHi能抑制縫隙連接的通訊，并促進(jìn)Cx43內(nèi)化。星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖也受pHi變化的影響。舉例說明:下降的pHi抑制了非活化的磷酸化b向活化的磷酸化a的轉(zhuǎn)換，因此減少了糖原分解。在大腦中，糖原幾乎只存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中。糖原隨著神經(jīng)元活性增強(qiáng)被快速消耗，這個(gè)過程為神經(jīng)元供能。對(duì)于許多星形膠質(zhì)細(xì)胞的信號(hào)處理過程，糖原分解同樣是非常重要的。這是一種理想的供能方式，因?yàn)樗恍?/p>

18、要磷酸化。并且它受生理信號(hào)的調(diào)節(jié)，包括各種遞質(zhì)引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高或細(xì)胞外鉀離子濃度的升高。高鉀，谷氨酸和腺苷引起的星形膠質(zhì)細(xì)胞ATP釋放也依賴于糖原分解?？傊?，氟西汀誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)堿化可能有益于星形膠質(zhì)細(xì)胞的縫隙連接和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在抑郁的動(dòng)物模型中，這些星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能是否更改也將是一個(gè)有趣的課題。
　　結(jié)論：
　　小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞中，氟西汀可以與5-HT2B受體結(jié)合通過MEK-ERK-RSK細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活NHE