MAPK信號(hào)通路在氯化鎘誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中作用的初步研究.pdf

1、目的：①體外分離、培養(yǎng)及鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞；②研究氯化鎘對(duì)體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡發(fā)生的影響；③探討 MAPK信號(hào)通路是否參與了鎘誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡過(guò)程。
　　方法：①取新生24h內(nèi)SD大鼠大腦皮質(zhì)組織，采用恒溫?fù)u床的方法純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，體外培養(yǎng)傳至第三代，采用GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定星形膠質(zhì)細(xì)胞;②以0、2.5、5、10、20、40μmol/L染毒12h、24h，MTT法測(cè)定氯化鎘對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用；③以0、2.5

2、、5、10、20、40μmol/L氯化鎘染毒12h，倒置相差顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化；④以20μmol/L氯化鎘染毒12h（對(duì)照組為0μmol/L氯化鎘的無(wú)血清DMEM作用12h），透射電鏡觀(guān)察星形膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；⑤以0、2.5、5、10、20μmol/L氯化鎘染毒12h，Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；⑥以0、2.5、5、10、20μmol/L氯化鎘染毒12h,Western blot方法檢測(cè)ER

3、K磷酸化水平和ERK水平。
　　結(jié)果：①純化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞，胞體大而扁，胞突豐富，初級(jí)胞突較多且長(zhǎng).細(xì)胞傳兩代后，經(jīng)GFAP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，陽(yáng)性細(xì)胞胞漿和突起呈棕黃色，星形膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)95％，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示氯化鎘對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有一定的細(xì)胞毒性，鎘濃度為2.5μmol/L時(shí)在各時(shí)間點(diǎn)（12h、24h)均未引起細(xì)胞存活率下降；細(xì)胞存活率在12h、24h時(shí)間點(diǎn)隨著染毒劑量（5~40μmol/L）的逐漸增加而

4、下降，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01)。③倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化：鎘濃度為（0~5μmol/L）時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)并未見(jiàn)到明顯改變；10μmol/L時(shí)細(xì)胞突起變細(xì)變短，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞無(wú)脫落現(xiàn)象；20μmol/L時(shí)，胞體收縮，突起消失或成毛刺狀，細(xì)胞稀疏，部分細(xì)胞收縮成球形，貼壁能力下降；40μmol/L時(shí)，細(xì)胞收縮成球形，大部分細(xì)胞脫壁，漂浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中；④透射電鏡觀(guān)察結(jié)果：對(duì)照組：胞核形態(tài)規(guī)則，各細(xì)胞器形態(tài)

5、正常；20μmol/L染毒12h:胞核形態(tài)不規(guī)則，核膜內(nèi)陷，線(xiàn)粒體呈現(xiàn)空泡樣變。⑤Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果：0、2.5、5、10、20μmol/L氯化鎘作用12h,細(xì)胞凋亡率分別為2.47％，2.71％，4.74％，17.78％，30.51％，(5~20μmol/L)鎘濃度時(shí)細(xì)胞凋亡率隨著染毒劑量的增加而增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01)。⑥Western blot檢測(cè)結(jié)果：(1