氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性影響及脂多糖誘導(dǎo)分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的影響及其機(jī)制.pdf

1、背景和目的：
　　近年來(lái)隨著對(duì)抑郁癥研究的不斷深入，其發(fā)病機(jī)制已經(jīng)不再僅局限于單純的神經(jīng)遞質(zhì)失調(diào)學(xué)說(shuō)。抑郁癥患者在服用抗抑郁藥物之后，不但神經(jīng)突觸間隙間5-羥色胺（5-serotonin,5-HT）、多巴胺(dopamine，DA）及去甲腎上腺素（noradrenalin，NA）濃度會(huì)升高，而且病人體內(nèi)的炎癥前細(xì)胞因子（Proinflammatorycytokines）水平也會(huì)較發(fā)病期間明顯降低。國(guó)內(nèi)外大量的體內(nèi)及體外研究發(fā)現(xiàn)炎癥

2、前細(xì)胞因子，諸如IL-1β、IL-6、NO及TNF-α等能夠通過(guò)影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化及神經(jīng)發(fā)生、海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷及再生修復(fù)及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性類因子，如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derivedneurotrophicfactor，BDNF）等的生成直接或者間接的導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中腦細(xì)胞的重要組成部分，它們不但起到支持、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元的功能，而且能夠分泌上述的多種炎癥前細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子分布及作用廣泛，并通過(guò)

3、特殊的途徑與神、免疫、內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用組成神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌系統(tǒng)，在應(yīng)對(duì)應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等過(guò)程中起到重要作用，而應(yīng)激及炎癥反應(yīng)過(guò)程可能參與到抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中。因此一些學(xué)者認(rèn)為炎癥前細(xì)胞因子在抑郁癥的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用。
　　大量的文獻(xiàn)表明：抑郁癥患者體內(nèi)的細(xì)胞因子如IL-1、IL-6、NO及TNF-α水平比正常人明顯升高，這些細(xì)胞因子對(duì)抑郁癥癥狀如抑郁心境、快感缺失、疲勞及睡眠障礙的發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用。經(jīng)抗抑郁藥物治療后

4、，細(xì)胞因子水平較前明顯降低。通過(guò)腹腔注射脂多糖(LPS)或者經(jīng)過(guò)21天慢性不可預(yù)測(cè)性應(yīng)激均可導(dǎo)致大鼠的行為性抑郁以及大鼠腦內(nèi)細(xì)胞因子含量增加。細(xì)胞因子在腦內(nèi)可作用于海馬區(qū)域抑制其神經(jīng)發(fā)生，而海馬區(qū)神經(jīng)發(fā)生減少也參與了抑郁癥的發(fā)病機(jī)制。注射抗抑郁藥物后可對(duì)抗這種作用。在細(xì)胞水平，大鼠腦膠質(zhì)細(xì)胞系體外培養(yǎng)經(jīng)過(guò)LPS或者IFN-γ等刺激后其分泌細(xì)胞因子水平明顯升高，給予抗抑郁藥物可以明顯抑制膠質(zhì)細(xì)胞系的活化增殖，而且減少了細(xì)胞因子分泌。

5、>　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察氟西汀對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響及其對(duì)脂多糖刺激的星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)IL-6及TNF-α分泌作用的影響，來(lái)驗(yàn)證抗抑郁藥對(duì)大鼠膠質(zhì)細(xì)胞系細(xì)胞因子分泌存在抑制作用，從側(cè)面驗(yàn)證細(xì)胞因子在抑郁癥中的作用并探討藥物作用機(jī)制。
　　材料和方法：
　　1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　1.1氟西汀對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響
　　星形膠質(zhì)細(xì)胞按照一定細(xì)胞濃度接種到96孔板中，利用（0,1,5,10,20,40,60）μΜ氟西汀孵

6、育細(xì)胞24h、48h、72h。利用MTT法觀察各濃度、時(shí)間細(xì)胞活性的變化。
　　1.2氟西汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響
　　將一定細(xì)胞濃度的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到48孔板，分為對(duì)照組、LPS組及氟西汀組，氟西汀組經(jīng)過(guò)（5,10,20,40）μΜ氟西汀預(yù)處理24h后，氟西汀組和LPS組同時(shí)經(jīng)1μ/g/ml的LPS刺激24h，對(duì)照組加入同體積稀釋液。24h后收集上清液，用Elisa法測(cè)上清液中細(xì)胞因子含量。

7、　　1.3星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-6的通路機(jī)制研究
　　將一定細(xì)胞濃度的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到48孔板，分為對(duì)照組、LPS組、PDTC組，氟西汀+PDTC組。PDTC組經(jīng)過(guò)（50,100,150,200）μΜPDTC預(yù)處理24h后氟西汀+PDTC組經(jīng)過(guò)相應(yīng)濃度的氟西汀和PDTC預(yù)處理24h，PDTC組、氟西汀+PDTC組和LPS組同時(shí)經(jīng)1μ/g/ml的LPS刺激24h，對(duì)照組加入同體積稀釋液。24h后收集上清液，用Elisa法測(cè)上清液中

8、細(xì)胞因子含量。
　　2、星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、純化和鑒定
　　2.1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)
　　取24-48h內(nèi)新生SD鼠4只，酒精消毒后斷頭取腦，打開顱骨，剝離腦膜，去掉嗅球，分離大腦皮層，放入2mlDMEM/F12培養(yǎng)基中，用無(wú)菌吸管機(jī)械吹打約200次，制備神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混懸液。經(jīng)200目鋼網(wǎng)過(guò)濾至無(wú)菌培養(yǎng)皿中以去除組織碎塊，將過(guò)濾后的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱30min去除成纖維細(xì)胞，再將去除纖維細(xì)胞的神

9、經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移至無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入含10％FBS的DMEM/F12，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后首次換液，此后每隔2-3d換液，培養(yǎng)約21d，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均可成熟。
　　2.2星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離純化和鑒定
　　混合膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)21d后，用1：4胰酶將星形膠質(zhì)細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞初步分離，定軌搖床法純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，行GFAP免疫熒光檢測(cè)，鑒定并估算星形膠質(zhì)細(xì)胞純度。
　　3、MTT法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的

10、活性
　　分別用濃度為0μΜ、1μΜ、5μΜ、10μΜ、20μΜ、40μΜ、60μΜ的氟西汀孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞24h、48h、72h，用MTT法檢測(cè)不同氟西汀濃度及時(shí)間星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。
　　4、IL-6及TNF-α檢測(cè)
　　純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞按照2×104或1×105接種到48孔板中，經(jīng)過(guò)（5、10、20、40）μΜ的氟西汀、（50、100、150、200）μΜ的PDTC處理后再用經(jīng)過(guò)1μg/ml的LPS刺激，收集細(xì)

11、胞上清液，用ELISA試劑盒檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞IL-6及TNF-α的分泌情況。
　　5、統(tǒng)計(jì)方法
　　應(yīng)用Excell2003和SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±S）表示，采用方差分析進(jìn)行比較，兩兩比較采用LSD法，方差不齊時(shí)采用DunnettT3檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有顯著性，P≤0.01為差異具有高度顯著性。
　　結(jié)果：
　　1.星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、分離、純化及鑒定
　　

12、星形膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)24h之后就有部分細(xì)胞貼壁，24h之后經(jīng)過(guò)第一次更換細(xì)胞培養(yǎng)液（簡(jiǎn)稱換液），去除沒(méi)有貼壁的細(xì)胞及殘留的組織碎片，此后每隔2-3d換液，在經(jīng)過(guò)21d后星形膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)成熟。星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)過(guò)胰酶初步消化分離后，GFAP細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示，陽(yáng)性細(xì)胞率僅在75%以上。經(jīng)過(guò)定規(guī)搖床法進(jìn)一步純化星形膠質(zhì)細(xì)胞，顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，可見(jiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞突起較明顯，長(zhǎng)短不一，細(xì)胞質(zhì)豐富，胞內(nèi)呈卵圓形的細(xì)胞核清晰

13、可見(jiàn)。星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下觀察：陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)射出綠色熒光，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞純度在95%以上。結(jié)果表明，定軌搖床法可以得到高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞，其純度至少為95%，為下一步的實(shí)驗(yàn)過(guò)程提供了純度較高的星形膠質(zhì)細(xì)胞。
　　2.氟西汀對(duì)體外培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響及LPS誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)TNF-α及IL-6分泌的影響及其作用機(jī)制
　　2.1氟西汀對(duì)體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響
　　相關(guān)研究已經(jīng)

14、發(fā)現(xiàn)抗抑郁藥物能夠促進(jìn)大腦神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生，減少炎性細(xì)胞因子對(duì)神經(jīng)元的損害，星形膠質(zhì)細(xì)胞為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中數(shù)量龐大的一種細(xì)胞，炎性細(xì)胞因子及自身分泌的細(xì)胞因子對(duì)其的損害更是相當(dāng)?shù)膹V泛。本實(shí)驗(yàn)中直接加入不同濃度的氟西汀分別刺激24h、48h及72h，觀察不同氟西汀濃度及時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響。
　　2.1.1相同時(shí)間不同濃度氟西汀刺激對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響
　　氟西汀濃度為（0，1，5，10，20，40，60）μΜ分別孵

15、育星形膠質(zhì)細(xì)胞24h、48h及72h，MTT法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性。結(jié)果顯示：氟西汀孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞24h后，氟西汀濃度為（20，40，60）μΜ時(shí)其OD值為（0.2291±0.01383，0.2447±0.01155,0.2714±0.01631），對(duì)照組OD值為（0.1979±0.01697），與對(duì)照組相比，差異具有顯著性（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01）；氟西汀孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞48h后，氟西汀濃度為60μΜ時(shí)OD值（0

16、.0329±0.00150）與對(duì)照組（0.2746±0.02443）及其它各組相比，差異具有高度顯著性（P＜0.01），其他濃度組與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；氟西汀孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞72h后，OD值在濃度為（10，20，40）μΜ時(shí)（0.3553±0.01176,0.3480±0.00851,0.3167±0.00973）與對(duì)照組（0.2421±0.02311）及氟西汀濃度為60μΜ（0.0619±0.00521）相比差異具有顯著性（P

17、＜0.05，P＜0.01），OD值在氟西汀濃度為60μΜ時(shí)與對(duì)照組相比，差異具有高度顯著性（P＜0.01）。
　　2.1.2、相同氟西汀濃度不同時(shí)間刺激對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響
　　氟西汀孵育24h、48h及72h后，氟西汀濃度為1μΜ時(shí)：其OD值分別為（0.1943±0.0106）、（0.2920±0.01483）及（0.3029±0.04246），48h、72h與24h相比，差異具有顯著性（P＜0.05）；氟西汀濃度為5

18、μΜ時(shí)：其OD值分別為（0.2095±0.02023）、（0.2850±0.00696）、（0.3144±0.00268），各組之間差異具有顯著性（P＜0.05）；氟西汀濃度為10μΜ時(shí)：其OD值分別為:（0.2131±0.01724）、（0.2938±0.01413）、（0.3553±0.91176），各組之間差異具有顯著性（P＜0.05）；氟西汀濃度為20μΜ時(shí)：其OD值分別為（0.2291±0.01383）、（0.2967±0.0

19、2622）、（0.3480±0.00851），各組之間差異具有顯著性（P＜0.05）；氟西汀濃度為40μΜ時(shí)：其OD值分別為（0.2447±0.01155）、（0.2679±0.01989）、（0.3167±0.00973），72h與24h、48h之間比較差異具有顯著性（P＜0.05），24h與48h比較差異不具有顯著性（P>0.05）；氟西汀濃度為60μΜ時(shí)：其OD值分別為（0.2714±0.01631）、（0.0329±0.0015

20、0）、（0.0619±0.00521），各組之間差異具有顯著性（P＜0.05）；
　　綜上，氟西汀在一定的濃度及時(shí)間范圍內(nèi)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖活性大致呈現(xiàn)劑量-時(shí)間依賴性，隨著濃度及時(shí)間的增加，氟西汀促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活性，但是當(dāng)氟西汀濃度達(dá)到60μΜ孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞48h或者72h，星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性明顯下降，可能是此濃度培養(yǎng)達(dá)48h或者72h后，對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞起到毒性負(fù)作用。
　　2.2.氟西汀對(duì)LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)

21、胞分泌TNF-α及IL-6的影響及其機(jī)制
　　2.2.1脂多糖對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α及IL-6的誘導(dǎo)作用
　　將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞按照2×104細(xì)胞/孔或1×105細(xì)胞/孔細(xì)胞密度接種到48孔板中，分為對(duì)照組和LPS刺激組，LPS刺激組用1μg/ml的LPS刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)照組加入相同體積的LPS稀釋液（含10%FBSDMEM/F12），孵育24小時(shí)后收集上清液，進(jìn)行Elisa法檢測(cè)上清液中TNF-α及IL-6