氟西汀經(jīng)由Cav-1-PTEN-AKT-GSK-3β通路雙向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原的含量.pdf

1、前言:重度抑郁(major depressive disorder，MDD)是全球發(fā)病率最高的精神障礙類疾病，全世界有近10％的人飽受抑郁癥病痛的折磨。MDD患者臨床表現(xiàn)主要有情緒低落、快感喪失、自卑感和對原有喜歡的事物喪失興趣并伴隨某些軀體癥狀。MDD患者腦內(nèi)病變涉及前額皮質(zhì)（prefrontal cortex，PFC）、前扣帶回皮質(zhì)、丘腦、海馬、杏仁核以及基底神經(jīng)節(jié)等多個區(qū)域，并與機體能量代謝失衡、炎癥、神經(jīng)可塑性改變以及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)

2、節(jié)異常相關(guān)。
　　近年來的研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central neuron system，CNS)的重要組成成份星形膠質(zhì)細胞與MDD具有密切的生物學(xué)相關(guān)性。MDD所引發(fā)的星形膠質(zhì)細胞的病理改變不是反應(yīng)性的細胞膠質(zhì)化或膠質(zhì)細胞的病理性肥大，而是細胞的膠質(zhì)性退化。選擇性地破壞腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞，即可以導(dǎo)致實驗動物產(chǎn)生抑郁樣行為。腦內(nèi)糖代謝率降低是MDD患者腦內(nèi)能量代謝異常表現(xiàn)之一，并且該代謝率降低的幅度與病情嚴重程度相關(guān)。經(jīng)帕羅西汀

3、等五羥色胺再攝取抑制劑(serotonin specificreuptake inhibitors，SSRIs)治療后，MDD患者腦內(nèi)病變區(qū)域的糖代謝可以得到回升。本課題組前期研究成果表明，發(fā)生于原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的糖酵解對于神經(jīng)細胞內(nèi)K+的緩沖、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞以及學(xué)習(xí)和記憶等生物學(xué)進程至關(guān)重要。
　　生物體內(nèi)的糖原代謝主要受磷酸化和變構(gòu)作用的調(diào)節(jié)。糖原合成激酶-3(glycogen synthase kinase3，GSK-

4、3)是參與糖原磷酸化調(diào)節(jié)的關(guān)鍵酶之一，最早發(fā)現(xiàn)于家兔骨骼肌分次提取物，存在旺和β兩種亞型。作為AKT下游的重要蛋白底物，GSK-3蛋白的活性改變常見于糖尿病和阿爾茲海默癥(Alzheimer's disease，AD)，并與情感障礙類疾病密切相關(guān)。同源性磷酸酶張力蛋白(phosphatase and tensinhomolog，PTEN)是人類發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重特異性磷酸酶活性的抑癌因子，它可以通過去磷酸化作用促進PIP3轉(zhuǎn)化為PIP

5、2，抑制GSK-3β上游通路PI3K/AKT的活性。有關(guān)肺纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，小窩蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）可以通過特定的蛋白結(jié)構(gòu)區(qū)域與PTEN蛋白結(jié)合并發(fā)生生物學(xué)相互作用，從而促進PTEN的膜錨定，最終影響其下游分子信號通路PI3K/AKT的轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　氟西汀是臨床上第一例人工合成的SSIRs類抗抑郁藥。該藥雖然能在短時間內(nèi)提升突觸間隙五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的濃度，但需要2-

6、4周才能顯效。由此可見，氟西汀的藥理學(xué)作用機制尚不明了，還有待進一步的研究。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀的藥理學(xué)活性之一是作為激動劑直接作用于原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞表面的5-HT2B受體。急性給藥處理后，可引發(fā)上皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor, EGFR）間接激活，進而影響星形膠質(zhì)細胞內(nèi)MAPK/ERK和PI3K/AKT兩大信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在隨后的肝性腦病研究中，本課題組還發(fā)現(xiàn)銨鹽可以經(jīng)

7、由Cav-1/PTEN/PI3K/AKT信號通路降低星形膠質(zhì)細胞內(nèi)GSK-3β的蛋白磷酸化水平，并影響腦內(nèi)的糖原代謝。由此可以推想:氟西汀長期作用很可能是通過調(diào)節(jié)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Cav-1的表達，影響星形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原的含量。針對這一假想，本論文通過一系列實驗檢測了:(i)氟西汀長期作用對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Cav-1蛋白表達的影響;(ii)氟西汀長期給藥對星形膠質(zhì)細胞膜上PTEN蛋白含量以及AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的影響;

8、(iii)氟西汀長期作用對離體星形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原含量的影響。
　　方法:1、應(yīng)用細胞原代培養(yǎng)技術(shù)分離并提取新生CD-1小鼠大腦皮層神經(jīng)膠質(zhì)細胞，經(jīng)2周培養(yǎng)獲得分化成熟的星形膠質(zhì)細胞。2、應(yīng)用RNAi技術(shù)下調(diào)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Cav-1的表達。3、應(yīng)用lysisbuffer和Trizol裂解液裂解并提取細胞胞漿內(nèi)的蛋白和細胞內(nèi)mRNA。4、應(yīng)用特制的膜制備液裂解并提取細胞膜蛋白。5、應(yīng)用Lowery法測定經(jīng)lysis buffer細胞裂

9、解液收集和提取的蛋白樣品的濃度。6、應(yīng)用western blotting技術(shù)檢測經(jīng)不同實驗處理因素作用之后，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)目的蛋白的含量和活性。7、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測經(jīng)不同濃度氟西汀(0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM)給藥2周后，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)PTEN mRNA的表達水平。8、應(yīng)用TECAN M200多功能酶標儀檢測經(jīng)不同濃度氟西汀（1μM和10μM）處理14天后，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)NADPH熒光強度值，由此間接測得星

10、形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原的含量。9、采用one-way ANOVA方法對結(jié)果進行分析統(tǒng)計，P＜0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1、實驗方法的鑒定。1）星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng);2）Lowery法可用于本實驗中蛋白樣品的定量;3）RNAi技術(shù)下調(diào)Cav-1的表達。2、不同濃度氟西汀的急性作用。不同濃度氟西汀（0.1μM、0.5μM、1μM、5μM和10μM）急性處理細胞（10分鐘、20分鐘、40分鐘和2小時）后，可得到AKT蛋白磷酸化

11、水平的濃度時間柱狀圖。經(jīng)藥物急性作用10分鐘后，只有高濃度組（5μM和10μM）樣品的AKT蛋白磷酸化水平增高;20分鐘后，AKT的蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)濃度依賴性地增高;40分鐘后，AKT磷酸化水平降低至正常水平，僅10μM組還留有微小的上升作用;2小時后，所有濃度組AKT蛋白磷酸化水平和對照組相比均無統(tǒng)計學(xué)差異。3、不同濃度氟西汀的長期作用。1）不同濃度氟西汀長期給藥可以雙向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Cav-1蛋白水平和膜PTEN蛋白含量，但不

12、影響細胞內(nèi)PTEN蛋白的含量。其中，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)Cav-1蛋白和質(zhì)膜上的PTEN蛋白含量呈現(xiàn)濃度依賴性改變，低濃度組（0.1μM、0.5μM和1μM）Cav-1蛋白表達水平和膜PTEN蛋白含量顯著減少，而高濃度組（5μM和10μM）Cav-1蛋白表達水平和膜PTEN蛋白含量顯著增加。1μM濃度組的Cav-1蛋白表達水平和膜PTEN蛋白含量下降最為明顯，10μM濃度組Cav-1蛋白表達水平和膜PTEN蛋白含量的升高幅度最大。2）不同濃度

13、氟西汀慢性處理雙向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)AKT和GSK-3β的蛋白磷酸化水平。其中，低濃度組（0.1μM、0.5μM和1μM）AKT和GSK-3β蛋白表達顯著增強，而高濃度組（5μM和10μM）的AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平則顯著下調(diào)，且高低濃度組間無統(tǒng)計學(xué)差異。3）PTEN抑制劑Bpv(HOpic)的作用。Bpv(HOpic)能夠抑制低濃度（0.1μM、0.5μM和1μM）氟西汀對AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的升高作用，同時也

14、能消除高濃度（5μM和10μM）氟西汀對AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的下調(diào)作用。4）RNAi的結(jié)果。Cav-1 siRNA轉(zhuǎn)染不能消除低濃度（0.1μM、0.5μM和1μM）氟西汀對AKT和GSK-3β蛋白磷酸化水平的升高作用，但能消除高濃度（5μM和10μM）氟西汀對AKT蛋白磷酸化水平的下調(diào)作用。4、不同濃度氟西汀慢性處理雙向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原的含量。經(jīng)1μM氟西汀作用2周后，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原的含量增加，而10μM氟西汀

15、作用2周后的結(jié)果與此相反。5、圖解氟西汀雙向調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原含量的機制。
　　討論:高GSK-3β蛋白活性是重度抑郁和雙相情感障礙的致病因素之一，GSK-3β基因表達的上調(diào)以及蛋白磷酸化水平的降低均可導(dǎo)致GSK-3β活性增強。過表達GSK-3β的小鼠可呈現(xiàn)抑郁前臨床表現(xiàn)，且對長期和緩刺激(chronic moderatestimulus，CMS)的敏感性增加。氟西汀急性給藥雖然不能緩解CMS所致的臨床表征，但經(jīng)氟西汀長期治療

16、后可以緩解這些行為學(xué)的異常。然而也有研究認為，抗抑郁治療會引發(fā)GSK-3β活性增高，例如長期服用舍曲林可增強老年抑郁癥患者血小板內(nèi)的GSK-3β活性。本論文的研究結(jié)果為該爭議提供了一個合理解釋，即該現(xiàn)象可能是基于SSRIs對細胞內(nèi)Cav-1基因表達的非線性調(diào)節(jié)。
　　與此同時，本論文的研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)氟西汀急性給藥之后，星形膠質(zhì)細胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平呈現(xiàn)給藥濃度依賴性地升高，但該急性激活效應(yīng)維持時間很短暫。藥物作用2小時后，星形

17、膠質(zhì)細胞內(nèi)AKT蛋白磷酸化水平即與對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，并且隨著給藥時間的延長，氟西汀長期作用逐漸顯現(xiàn)。此外，本論文通過應(yīng)用RNAi技術(shù)以及抑制劑Bpv(HOpic)，特異性地下調(diào)Cav-1表達或抑制PTEN蛋白的活性，進一步證實了氟西汀可以經(jīng)由Cav-1/PTEN/AKT/GSK-3β通路對星形膠質(zhì)細胞內(nèi)糖原含量進行雙向調(diào)控。
　　結(jié)論:本論文首次對氟西汀長期給藥對GSK-3β活性的雙向調(diào)控作用進行了探究:氟西汀長期給藥可通過雙向