胰島素經(jīng)PI3K-GSK3β信號通路調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素-1基因表達(dá).pdf

1、胰島素激活P13激酶(P13K)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)兩條主要信號通路，現(xiàn)已知P13K／Akt通路介導(dǎo)胰島素刺激內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮(NO)產(chǎn)生；但不清楚P13K／Akt通路是否參與胰島素刺激內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因表達(dá)。胰島素激活P13K／Akt，進(jìn)而磷酸化9位絲氨酸殘基(Ser9)導(dǎo)致糖原合酶激酶-3β(GSK3β)滅活。GSK3β是一種多功能的絲氨酸／蘇氨酸激酶，可磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子并調(diào)節(jié)其活性，例如：改變轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合

2、能力。作為胰島素信號下游的重要激酶，GSK3β是否參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因表達(dá)，尚未見文獻(xiàn)報道。 人ET-1基因啟動子含TATA框，其活性受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)，如：AP-1、含鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)；但這些轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)并不局限于血管內(nèi)皮細(xì)胞；因而，這些因子單獨作用不大可能引起胰島素誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因ET-1表達(dá)。血管內(nèi)皮鋅指-1(Vezf1)與ET-1核心啟動子結(jié)合，是調(diào)節(jié)細(xì)胞特異

3、性基因ET-1在內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的潛在靶點。目前尚不清楚Vezfl是否參與胰島素對內(nèi)皮細(xì)胞ET-1表達(dá)的調(diào)節(jié)。 本課題研究： (1)胰島素對GSK3β滅活作用是否引起內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因表達(dá)增加； (2)胰島素上調(diào)ET-1啟動子活性是否由P13K介導(dǎo)； (3)Vezf1是否參與胰島素信號對內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因表達(dá)調(diào)節(jié)。研究目的在于闡明胰島素調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1表達(dá)的分子機(jī)制。 材料和方法： 1

4、.細(xì)胞培養(yǎng) 人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)生長于含2％胎牛血清(FBS)的EBM-2培養(yǎng)液中。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，用含4％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。 2.胰島素和氯化鋰(LiCI)處理單層培養(yǎng)的人肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAEC)血清饑餓6 h后，加入含O-100 nM重組豬胰島素或20 mM LiCI(GSK3p抑制劑)條件培養(yǎng)液，37℃孵育1 h。用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測培養(yǎng)上清液ET-1多肽

5、含量或用Real time定量RT-PCR(qRT-PCR)分析細(xì)胞ET-1 mRNA水平。部分細(xì)胞經(jīng)胰島素或LiCI處理后，用4％甲醛固定，ELISA法檢測細(xì)胞的Ser9磷酸化GSK3p和總GSK3β蛋白水平(GSK3β活性)。 3.GSK3β siRNA和Vezf1 siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞單層PAEC分別轉(zhuǎn)染GSK3β／Vezf1 siRNA和control siRNA(不針對某種特殊序列)。37℃孵育72 h后。用ELIS

6、A法測定培養(yǎng)上清液ET-1含量；采用qRT-PCR分析細(xì)胞ET-1和GSK3β/Vezf1基因表達(dá)；siRNA對目標(biāo)蛋白的抑制作用經(jīng)Westem blot分析證實。 4.重組腺病毒Ad5-GSK3β感染內(nèi)皮細(xì)胞人PAEC分別感染染重組共表達(dá)GSK3β基因和GFP基因的腺病毒表達(dá)載體(Ad5-GSK3β)和僅表達(dá)GFP基因的空白腺病毒(Ad5-GFP)：細(xì)胞感染后在含或不含18 nM胰島素條件培養(yǎng)液中孵育1 h。ELISA法檢測培

7、養(yǎng)上清液ET-1含量；qRT-PCR分析細(xì)胞ET-1基因表達(dá)。 5.報告基因質(zhì)粒構(gòu)建和熒光素酶檢測從人基因組DNA調(diào)取ET-1基因啟動子(-832／+171bp)片斷；將其插入報告基因質(zhì)粒pGL3-Basic，形成重組質(zhì)粒pGL3-ET1。以構(gòu)建好的pGL3-ET1為基礎(chǔ)，將其中Vezf1結(jié)合位點(-47bp處)“TTACCCCCACTC“突變成“TTACATCCACTC"，形成一個突變質(zhì)粒pGL3-ET1-m。HUVEC用L

8、ipofectin Reagent轉(zhuǎn)染pGL3-ET1／pGL3-ET1-m；共轉(zhuǎn)染pRL-SV40(含SV40啟動子的海腎熒光素酶報告基因質(zhì)粒)作為內(nèi)參照。轉(zhuǎn)染48 h后，用100 nM胰島素刺激1、3和6 h；部分細(xì)胞在胰島素刺激前30 min至刺激結(jié)束，培養(yǎng)液中含濃度為100 nM的Wortmannin(P13K抑制劑)或10 μM的PD-98059(MAPK抑制劑)；雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)(Dual-Luciferse Repo

9、rter Assay System)檢測熒光素酶活性(表示ET-1啟動子活性)。 結(jié)果： 1.胰島素刺激人內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET-1人PAEC用10、100 nM胰島素刺激1 h；培養(yǎng)上清液中ET-1含量比對照組明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，并呈劑量依賴效應(yīng)。 2.GSK3p抑制劑LiCl模仿胰島素刺激內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因表達(dá)人PAEC用100 nM胰島素或20 mM LiCl條件培養(yǎng)液處理1 h后，GSK3

10、β的Ser9磷酸化水平比對照組明顯增高(P＜0.01)，提示LiCl模仿胰島素抑制GSK313活性。PAEC用10、100 nM胰島素或20 mM LiCl刺激1 h，細(xì)胞ET-1mRNA水平明顯高于相應(yīng)對照組(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果表明GSK3β活性抑制與培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因表達(dá)上調(diào)有關(guān)。 3.特異性抑制GSK3p表達(dá)上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1 mRNA表達(dá)和ET-1多肽釋放為進(jìn)一步證實GSK313對ET-1基因表達(dá)

11、的影響，人PAEC轉(zhuǎn)染GSK3βsiRNA/control siRNA后，細(xì)胞和培養(yǎng)上清液分別用于qRT-PCR和ELISA分析。GSK3β siRNA轉(zhuǎn)染的人內(nèi)皮細(xì)胞GSK3β mRNA表達(dá)僅為control siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的20％，證實siRNA成功抑制GSK3β基因表達(dá)。GSK3β沉默分別上調(diào)ET-1mRNA表達(dá)50％(P＜0.01)和ET-1多肽釋放100％(P＜0.01)。結(jié)果證實GSK3β活性抑制可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1

12、mRNA轉(zhuǎn)錄和ET-1多肽釋放。 4.過表達(dá)GSK3β基因減弱胰島素對ET-1表達(dá)的刺激作用為闡明GSK3β在胰島素調(diào)節(jié)ET-1產(chǎn)生中的作用，人PAEC感染共表達(dá)GSK3β和GFP重組腺病毒后，qRT-PCR和ELISA分別檢測細(xì)胞ET-1基因轉(zhuǎn)錄與ET-1多肽分泌。與空白病毒(無插入片斷)感染細(xì)胞相比，過表達(dá)GSK3β表達(dá)明顯減弱胰島素對ET-1 mRNA表達(dá)(P＜0.01)和ET-1多肽釋放的刺激作用(P＜0.05)；結(jié)果支

13、持GSK3β負(fù)調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1轉(zhuǎn)錄與ET-1分泌。 5.Vezfl調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1表達(dá)為確定Vezf1是否調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因表達(dá)，人PAEC轉(zhuǎn)染Vezf1 siRNA后，細(xì)胞和培養(yǎng)上清液用于qRT-PCR和ELISA分析。Vezf1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞Vezf1 mRNA水平僅為control siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的9％，而相應(yīng)ET-1 mRNA表達(dá)和ET-1多肽釋放僅分別為control siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的20％

14、和40％(P＜0.01)；結(jié)果表明Vezfl參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞ET-1基因轉(zhuǎn)錄和ET-1多肽釋放。 6.胰島素上調(diào)ET-1基因啟動子活性由P13K介導(dǎo)現(xiàn)有研究已經(jīng)證明，細(xì)胞內(nèi)胰島素滅活GSK3β主要由P13K介導(dǎo)。為確定內(nèi)皮細(xì)胞中胰島素信號刺激ET-1基因表達(dá)是否由P13K介導(dǎo)，HUVEC共轉(zhuǎn)染報告基因質(zhì)粒pGL3-ET1和pRL-SV40，37℃孵育48 h后，加入含100 nM胰島素培養(yǎng)液37℃，孵育1、3和6 h；部分細(xì)胞在

15、胰島素刺激之前30min和刺激期間，培養(yǎng)液中含100 nM的Wortmannin或10 μM的PD-98059；用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測ET-1啟動子活性。Wortmannin和PD-98059在無胰島素刺激條件下對ET-1啟動子活性無明顯影響(P＞0.05);胰島素刺激后各時間點ET-1啟動子活性比對照組(無胰島素刺激)明顯增強(qiáng)(P＜0.05或P＜0.01)；胰島素+Wortmannin組ET-1啟動子活性明顯低于胰島素單獨處理組(

16、P＜0.05或P＜0.01)，而與對照組相比，無顯著性差異(P＞0.05)；胰島素+PD-98059組ET-1啟動子活性與胰島素單獨處理組比較，無顯著性差異(P＞0.05)，且明顯高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)。結(jié)果說明胰島素上調(diào)ET-1基因啟動子活性由P13K介導(dǎo)。 7.Vezfl參與胰島素對ET-1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)為證實胰島素調(diào)節(jié)ET-1表達(dá)是否通過轉(zhuǎn)錄因子Vezf1發(fā)揮作用，HUVEC分別轉(zhuǎn)染pGL3-ET1和Ve

17、zf1結(jié)合序列突變質(zhì)粒pGL3-ET1-m；轉(zhuǎn)染48 h后，加入含100 nM胰島素培養(yǎng)液，37.℃孵育6 h；雙熒光素酶檢測試劑盒檢測ET-1啟動子活性。胰島素明顯上調(diào)轉(zhuǎn)染pGL3-ET1內(nèi)皮細(xì)胞的ET-1啟動子活性(P＜0.05)；而轉(zhuǎn)染pGL3-ET1-m內(nèi)皮細(xì)胞的ET-1啟動子活性在胰島素刺激后與對照組無明顯差異。結(jié)果說明Vezf1參與胰島素對ET-1基因表達(dá)調(diào)節(jié)。 結(jié)論： 1.本實驗首次發(fā)現(xiàn)P13K-GSK3β