丹蔞片通過PI3K-Akt信號通路促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移的機制研究.pdf

1、目的：
　　以人動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）為培養(yǎng)模型，觀察丹蔞片對細(xì)胞增殖、遷移的作用及其相關(guān)功能蛋白、信號通路蛋白的表達(dá)。探索丹蔞片促 HAEC細(xì)胞增殖和遷移的可能機制。
　　方法：
　　1.實驗分組：本實驗共分為五組，即血清饑餓組、空白對照組、丹蔞片組、可定組和混合組。每組由相應(yīng)10％含藥血清作用24小時后，進(jìn)行后續(xù)實驗。
　　2.含藥血清的制備：新西蘭白兔16只，隨機分為四組，每組4只。分別給予丹蔞片2.

2、5g/kg/d、可定5mg/kg/d、丹蔞片2.5g/kg/d+可定5mg/kg/d灌胃，空白對照組以等體積生理鹽水灌胃。連續(xù)灌胃5天后，腹主動脈采血，離心取上清，-70℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?br>　　3.HAEC細(xì)胞增殖活力的測定：取指數(shù)生長期HAEC細(xì)胞，調(diào)整密度以2×103個/孔的密度接種于96孔板，完全貼壁后，無血清同步化24h。加不同10%含藥血清作用24h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清于-70℃冰箱凍存?zhèn)溆?。CellTiter-Glo化學(xué)發(fā)

3、光法測各組細(xì)胞增殖活力。
　　4.HAEC細(xì)胞遷移能力的測定：取指數(shù)生長期 HAEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/ml，取200μl單細(xì)胞懸液接種 Transwell小室上層。各組小室下層加入600μl細(xì)胞培養(yǎng)上清液，溫箱孵育24h后鏡下觀察各組遷移細(xì)胞數(shù)。
　　5.檢測各組細(xì)胞VEGF、SDF-1和eNOS含量：ELISA法測含藥血清作用24h時后的細(xì)胞培養(yǎng)上清VEGF、SDF-1、eNOS的含量。
　　6.檢測

4、各組HAEC細(xì)胞周期變化：各組含藥血藥作用24h后，收集細(xì)胞，用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組 HAEC細(xì)胞周期各時相變化。
　　7.檢測各組HAEC細(xì)胞周期相關(guān)蛋白PCNA、Cyclin D1、CDK4的表達(dá)水平：采用Western blot法檢測含藥血清作用24h后，各組細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、CDK4、PCNA的表達(dá)水平。
　　8.檢測各組 HAEC細(xì)胞信號通路相關(guān)蛋白 PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt的表達(dá)

5、水平：采用Western blot法檢測含藥血清作用24h后，各組PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.細(xì)胞增殖活力：結(jié)果顯示與血清饑餓組和空白對照組相比，丹蔞片組、可定組和混合組細(xì)胞增殖活力顯著增加（P<0.01）；可定組增殖率高于丹蔞片組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（43.49%±1.79% vs.42.88%±0.77%，P>0.05）；而混合組顯著性高于可定組、丹蔞片組（102.52%

6、±5.73% vs.43.49%±1.79%，102.52%±5.73%vs.42.88%±0.77%，均P<0.01）。
　　2.細(xì)胞遷移能力：Transwell實驗結(jié)果顯示三個用藥組促細(xì)胞遷移作用均顯著高于血清饑餓組和空白對照組（P<0.01）；200倍光鏡下可見可定組細(xì)胞遷移的個數(shù)多于丹蔞片組（65.60±7.30 vs.63.40±5.08個），但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；而混合組促細(xì)胞遷移的能力均高于可定組、丹蔞片組

7、（97.40±14.57 vs.65.60±7.30個，97.40±14.57 vs.63.40±5.08個，均P<0.05）。
　　3.細(xì)胞周期分布：流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示與血清饑餓組、空白對照組相比，三個用藥組細(xì)胞增殖指數(shù)（PI）均明顯增加（P<0.01）；而混合組 PI明顯高于丹蔞片組和可定組（58.34%±2.05% vs.51.87%±2.21%，58.34%±2.05% vs.50.74%±1.89%，均 P<0.01）；

8、但丹蔞片組與可定組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（51.87%±2.21%vs.50.74%±1.89%，P>0.05）。
　　4.各組細(xì)胞VEGF、SDF-1、eNOS的表達(dá)：與血清饑餓組、空白對照組比較，三個用藥組VEGF、SDF-1和eNOS的分泌水平明顯增加（P<0.01或P<0.05）；且混合組顯著高于丹蔞片組和可定組（P<0.01或P<0.05）；而丹蔞片組與可定組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　5.各組細(xì)胞周

9、期相關(guān)蛋白PCNA、CyclinD1和CDK4的表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示①PCNA表達(dá)：與血清饑餓組、空白對照組比較，三個用藥組 PCNA表達(dá)均明顯上調(diào)（P<0.01）;但三個用藥組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。②Cyclin D1表達(dá)：與血清饑餓組、空白對照組比較，三個用藥組 Cyclin D1表達(dá)量顯著增加（P<0.01）；且混合組顯著高于丹蔞片組和可定組（P<0.01）；而丹蔞片組較可定組差異無統(tǒng)計學(xué)意

10、義（P>0.05）。③CDK4表達(dá)：各組 CDK4蛋白表達(dá)量均無明顯變化（P>0.05）。
　　6.各組PI3K、Akt、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)：Western blot結(jié)果顯示①PI3K和p-PI3K表達(dá)：各組PI3K蛋白表達(dá)量無明顯變化（P>0.05）；與血清饑餓組、空白對照組比較，三個用藥組 p-PI3K表達(dá)均明顯上調(diào)（P<0.01）；且混合組明顯高于丹蔞片組和可定組（P<0.05）；但丹蔞片組和可定組比較，差異無

11、統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。②Akt和p-Akt表達(dá)：與血清饑餓組比，其余各組Akt蛋白表達(dá)量上調(diào)（P<0.01）；但其余各組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而三個用藥組 p-Akt蛋白表達(dá)量與血清饑餓組、空白對照組相比明顯上調(diào)（P<0.01）；且混合組顯著高于丹蔞片組、可定組（P<0.01）；而可定組與丹蔞片組比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.丹蔞片具有促離體人動脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、改