HMGA1 通過ILK-AKt-GSK-3β信號通路促進了肝癌細胞的增殖和侵襲.pdf

1、第一部分：HMGA1 shRNA干擾序列的篩選
　　目的：
　　本部分為探討HMGA1和ILK信號通路在肝癌中的聯(lián)系，首先設(shè)計合成了3個針對 HMGA1基因的 shRNA干擾序列和1個陰性對照序列。通過實時定量PCR檢測，篩選出了干擾效率最高的shRNA序列。然后將該序列構(gòu)建成慢病毒表達載體，以達到高效穩(wěn)定的 HMGA1低表達狀態(tài)，從而為后續(xù)的實驗打下良好的基礎(chǔ)。
　　方法：
　　HMGA13個shRNA質(zhì)粒和1

2、個陰性對照質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后48h收獲細胞，進行Realtime-PCR檢測HMGA1 mRNA表達水平。上述篩選得到的最佳干擾序列構(gòu)建成慢病毒干擾載體，感染細胞并于72 h收獲細胞，進行Western blot檢測HMGA1蛋白表達。并用熒光顯微鏡觀察病毒感染效率。
　　結(jié)果：
　　1 HMGA1 shRNA干擾序列的篩選
　　Realtime PCR結(jié)果顯示：shNC對HMGA1的mRNA表達無明顯抑制作

3、用（P＞0.05），而3個 HMGA1 shRNA干擾序列均能顯著抑制 MHCC97H細胞中HMGA1 mRNA的表達水平（P＜0.05），其中 HMGA1-shRNA-2對 HMGA1 mRNA表達的沉默效率最高（P＜0.05）。因此，將HMGA1-shRNA-2和shNC構(gòu)建成慢病毒載體，使干擾效果更加穩(wěn)定。
　　2慢病毒LV-HMGA1-shRNA轉(zhuǎn)染效率檢測
　　熒光顯微鏡及普通光鏡下視野對比，可見 LV-HMGA1

4、-shRNA及 LV-shNC轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞后，熒光表達率均在80％以上。
　　3 LV-HMGA1-shRNA對MHCC97H細胞HMGA1蛋白表達水平的抑制作用用Western blot檢測結(jié)果顯示，LV-shNC對HMGA1的蛋白表達無明顯抑制作用（P＞0.05），而感染了LV-HMGA1-shRNA的MHCC97H細胞HMGA1蛋白表達水平明顯下調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：本部分篩選出了干擾HMGA1的最

5、佳shRNA序列，并針對其構(gòu)建的慢病毒載體，高效地感染了MHCC97H細胞，顯著下調(diào)了HMGA1的表達。
　　第二部分：HMGA1調(diào)控了ILK/Akt/GSK-3β信號通路
　　目的：
　　本部分研究HMGA1對ILK/Akt/GSK-3β信號通路的調(diào)節(jié)作用。
　　方法：
　　將 MHCC97H細胞種植于6孔板中。種板后第2天，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將濃度為4μg/孔ILK質(zhì)粒和空載質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞

6、。轉(zhuǎn)染6h后,加入含有LV-shNC和LV-HMGA1-shRNA病毒的培養(yǎng)液。于細胞感染后的48h，加入MK-2206和DMSO對照使終濃度為5μmol/L，孵育24h后提取細胞總RNA和蛋白進行Realtime PCR和western blot檢測HMGA1和ILK的表達。western blot檢測p-Akt、p-GSK-3β的表達。實驗分為7組：1）空白對照組2）LV-sh NC3）LV-HMGA1-shRNA4）LV-HMGA

7、1-shRNA+ GV144-EGFP5）LV-HMG A1-shRNA+GV144-EGFP-ILK6）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMS O7）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+MK-2206
　　結(jié)果：
　　1 HMGA1和ILK mRNA和蛋白表達水平的變化
　　Real-time PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和LV-shN

8、C組相比，LV-HMGA1-shRNA組和 LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP5組的細胞HMGA1的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），而ILK過表達質(zhì)粒和MK-2206的加入均對HMGA1的表達無明顯影響（P＞0.05）。與空白對照組和 LV-shNC組相比， LV-HMGA1-shRNA組和 LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組的細胞ILK的mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.

9、05）， LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和 LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組 ILK mRNA和蛋白表達水平與 LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組相比明顯升高（P＜0.05），MK-2206的加入對ILK的表達無明顯影響（P＞0.05）。
　　2 p-Akt和p-GSK-3β的表達水平
　　Western b

10、lot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和 LV-shNC組相比， LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP5組的細胞p-Akt和p-GSK-3β的蛋白表達水平均明顯降低（ P＜0.05）， LV-HMGA1–shRNA+GV144-EGFP-ILK和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組p-Akt和 p-GSK-3β蛋白表達水平與 LV-HMGA1-shRNA組和 L

11、V-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組相比明顯升高（P＜0.05），而 LV-HMGA1–shRNA+GV144-EGFP-ILK+MK-2206組的 p-Akt和 p-GSK-3β的蛋白表達水平較 LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組明顯降低（P＜0.05）。Akt和GSK-3β總蛋白水平無明顯改變。
　　結(jié)論：HMGA1

12、在肝癌細胞中調(diào)控了ILK/Akt/GSK-3β信號通路。
　　第三部分：HMGA1通過調(diào)控ILK/Akt/GSK-3β信號通路促進了肝癌細胞的增殖和存活
　　目的：
　　本部分研究HMGA1是否通過調(diào)控ILK/Akt/GSK-3β信號通路促進了肝癌細胞的增殖和存活。
　　方法：
　　利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將濃度為4μg/孔ILK質(zhì)粒和空載質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞。轉(zhuǎn)染6h后,加入含有LV-shNC和LV-H

13、MGA1-shRNA病毒的培養(yǎng)液。于細胞感染后的48h，加入MK-2206和DMSO對照使終濃度為5μmol/L，孵育24h后用CCK-8檢測細胞增殖活力和流式細胞儀檢測細胞凋亡。實驗分7組：1）空白對照組2）LV-shNC3）LV-HMGA1-shRNA4）LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP5）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK6）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+D

14、MSO7）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+MK-2206
　　結(jié)果：
　　1各組細胞增殖活力的變化
　　CCK-8檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和LV-shNC組相比，LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組的細胞增殖水平明顯降低（P＜0.05）， LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和 LV-HMGA1-shRNA+GV144

15、-EGFP-ILK+DMSO組細胞增殖水平與 LV-HMGA1-shRNA組和 LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組相比明顯升高（ P＜0.05），而 LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP-ILK+MK-2206組的細胞增殖水平較 LV-HMGA1- shRNA+ GV144-EGFP-ILK和 LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組明顯降低（ P＜0.05）。
　

16、　2各組細胞凋亡水平的變化
　　流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和LV-shNC組相比，LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組的細胞凋亡水平明顯增加（P＜0.05），LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和 LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組細胞凋亡水平與LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shR NA+ GV

17、144-EGFP5組相比明顯降低（P＜0.05），而LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+MK-2206組的細胞凋亡水平較LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-I LK和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組明顯升高（P＜0.05）。結(jié)論：HMGA1通過調(diào)控ILK/Akt/GSK-3β信號通路促進了肝癌細胞的增殖和存活第四部分：HMGA1通過調(diào)控ILK/Akt/GSK-

18、3β信號通路促進了肝癌細胞的侵襲和遷移
　　目的：
　　本部分研究HMGA1是否通過調(diào)控ILK/Akt/GSK-3β信號通路促進了肝癌細胞的侵襲和遷移。
　　方法：
　　利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將濃度為4μg/孔ILK質(zhì)粒和空載質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞。轉(zhuǎn)染6h后,加入含有LV-shNC和LV-HMGA1-shRNA病毒的培養(yǎng)液。于細胞感染后的48h，加入MK-2206和DMSO對照使終濃度為5μmol/L，孵育2

19、4h后用Rranswell檢測細胞侵襲和劃痕實驗檢測細胞遷移。實驗分7組：1）空白對照組2）LV-shNC3）LV-HMGA1-shRNA4）LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP5）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK6）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO7）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+MK-2206
　　結(jié)果：
　　1各

20、組細胞侵襲能力的變化
　　Transwell檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和 LV-shNC組相比， LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組的細胞侵襲能力明顯降低（ P＜0.05）， LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和 LV-HMGA1–shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組細胞侵襲能力與LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA

21、+GV144-EGFP5組相比明顯升高（P＜0.05），而LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+MK-2206組的細胞侵襲能力較LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組明顯降低（P＜0.05）。
　　2各組細胞遷移能力的變化
　　劃痕結(jié)果顯示，與空白對照組和LV-shNC組相比，LV-HMGA1-shRNA組和LV

22、-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組的細胞遷移能力明顯降低（ P＜0.05），LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和 LV-HMGA1-shRNA+GV144- EGFP-ILK+DMSO組細胞遷移能力與 LV-HMGA1-shRNA組和 LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5組相比明顯升高（ P＜0.05），而 LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP-ILK+MK-220

23、6組的細胞遷移水平較 LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組明顯降低（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　HMGA1通過調(diào)控ILK/Akt/GSK-3β信號通路促進了肝癌細胞的侵襲和遷移。
　　第五部分：cyclinD1、c-Myc、MMP2、MMP9可能是HMGA1/ILK/Akt/GSK-3β信號通路的下游效應(yīng)器
　　目

24、的：
　　本部分研究HMGA1/ILK/Akt/GSK-3β信號通路可能的下游效應(yīng)器。
　　方法：
　　將MHCC97H細胞種植于6孔板中。種板后第2天，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將濃度為4μg/孔ILK質(zhì)粒和空載質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染MHCC97H細胞。轉(zhuǎn)染6h后,加入含有LV-shNC和LV-HMGA1-shRNA病毒的培養(yǎng)液。于細胞感染后的48h，加入MK-2206和DMSO對照使終濃度為5μmol/L，孵育24h后提取細胞總RNA

25、和蛋白進行Realtime PCR和western blot檢測cyclinD1、c-Myc、MMP2、MMP9的表達。實驗分為7組：1）空白對照組2）LV-shNC3）LV-HMGA1-shRNA4） LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP5）LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK6） LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO7）LV-HMGA1-shRNA+GV144–EG

26、FP-ILK+MK-2206
　　結(jié)果：
　　2.1各組MMP2、MMP9、cyclinD1和c-Myc mRNA表達水平的變化
　　Realtime PCR檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和LV-shNC組相比，LV-HMG A1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP5組的細胞MMP2、MMP9、cyclinD1和c-Myc的mRNA表達水平均明顯降低（P＜0.05），LV-HMGA1-shR

27、 NA+GV144-EGFP-ILK和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組MM P2、MMP9、cyclinD1和c-Myc mRNA表達水平與LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP5組相比明顯升高（P＜0.05），而LV-HMGA1-s hRNA+GV144-EGFP-ILK+MK-2206組的MMP2、MMP9、cyclinD1和c-Myc的mRNA表達

28、水平較LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和LV-HMGA1-shRN A+GV144-EGFP-ILK+DMSO組明顯降低（P＜0.05）。
　　2.2各組MMP2、MMP9、cyclinD1和c-Myc蛋白表達水平的變化
　　Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組和 LV-shNC組相比，LV-HMG A1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP5組的細胞MM

29、P2、MMP9、cyclinD1和c-Myc的蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05），LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK和LV-HMGA1-shRNA+GV144-EGFP-ILK+DMSO組MMP2、MMP9、cyclinD1和c-Myc蛋白表達水平與LV-HMGA1-shRNA組和LV-HMGA1-shRNA+ GV144-EGFP5組相比明顯升高（P＜0.05），而LV-HMGA1-shRNA+GV144-