NSAIDs通過Akt-GSK3β-NAG-1信號(hào)通路誘導(dǎo)COX-2不表達(dá)胃癌細(xì)胞凋亡作用的研究.pdf

1、環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)是將花生四烯酸(AA)代謝為前列腺素(PGs)的關(guān)鍵限速酶?，F(xiàn)已證實(shí)，COX至少存在三種異構(gòu)酶，即結(jié)構(gòu)型COX-1和誘導(dǎo)型COX-2以及最近發(fā)現(xiàn)的COX-3。COX-1廣泛分布于各種組織，尤其是胃腸道、腎臟及血小板中，促進(jìn)生理性PGs的合成，調(diào)節(jié)正常腎臟、胃腸道功能及維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，發(fā)揮“看家功能”。而COX-2在正常細(xì)胞中不表達(dá)或極少表達(dá)，刺激原如細(xì)胞因子、內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)以及促癌劑

2、等可顯著上調(diào)該酶的表達(dá)。COX-3主要分布在腦和脊髓，其產(chǎn)生的PGD2參與介導(dǎo)痛覺和發(fā)熱反應(yīng)。已有的研究表明COX-2高表達(dá)于結(jié)腸癌、胃癌等惡性腫瘤組織。進(jìn)一步研究顯示選擇性COX-2抑制劑可抑制動(dòng)物模型胃癌的發(fā)生和發(fā)展以及多種消化道腫瘤細(xì)胞株的生長。而且長期應(yīng)用非甾體類消炎藥(NSAIDs)的人群中，大腸癌、胃癌等的發(fā)病率及死亡率較對(duì)照人群明顯降低。提示COX-2的表達(dá)可能與胃腸道腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。盡管目前NSAIDs尤其一些

3、COX-2選擇性抑制劑在消化道腫瘤防治中的作用已被廣泛認(rèn)可，但其作用機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為這種非COX-2依賴性途徑可能包括以下分子機(jī)制：1)抑制PPARδ誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡或激活PPARy抑制腫瘤細(xì)胞的生長，2)抑制IKKβ-NF-kB信號(hào)通路和3)抑制Akt信號(hào)通路等。 第一部分NSAIDs誘導(dǎo)COX/2不表達(dá)胃癌細(xì)胞凋亡目的：選擇性COX-2抑制劑celecoxib和非選擇性COX抑制劑indomethacin是否誘導(dǎo)

4、COX-2不表達(dá)胃癌細(xì)胞株的凋亡。 方法：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)，MTT法測定celecoxib和indomethacin對(duì)細(xì)胞存活率的影響，Hoechst33258染色，DNA瓊脂糖凝膠電泳和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測celecoxib和indomethacin處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，DNA斷裂情況和DNA含量的變化。 結(jié)果： 1.胃癌細(xì)胞株AGS、HGC-27、BGC-823、SGC-7901和MG

5、C-803均有COX-1的表達(dá)。COX-2在胃癌細(xì)胞株AGS、HGC-27和BGC-823中有高表達(dá)，而在SGC-7901和MGC-803中未見表達(dá)。 2.不同濃度celecoxib(10～100μM)和indomethacin(100～1200μM)處理MGC-803細(xì)胞12h、24h、48h后，細(xì)胞的存活率明顯降低，其作用呈濃度和時(shí)間依賴性。100μMcelecoxib處理細(xì)胞12h、24h、48h后，細(xì)胞存活率分別為64.

6、6±3.8％，46.1±2.8％，28.4±43.5％。1mMindomethacin作用于細(xì)胞12h、24h、48h后，細(xì)胞存活率分別為74.5±8.6％，52.2±3.4％，35.5±4.8％。 3.Hoechst33258核染色顯示正常生長的MGC-803細(xì)胞的胞核呈彌散均勻熒光，核無固縮，呈現(xiàn)體積較大的淺染核形態(tài)；100μMcelecoxib和1mMindomethacin作用12h后細(xì)胞核形態(tài)不規(guī)則，呈現(xiàn)波紋狀或折縫狀

7、，部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；24h后細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝集、邊緣化；48h后，細(xì)胞核染色質(zhì)裂解為塊狀，產(chǎn)生凋亡小體等典型的凋亡特征。 4.Celecoxib(100μM)和indomethacin(1mM)分別作用12h、24h和48h后，細(xì)胞DNA出現(xiàn)明顯的梯狀條帶，即"DNAladder"。且隨作用時(shí)間的延長，DNA斷裂程度加重。 5.100μMcelecoxib分別作用12h、24h和48h后，各處理組均出現(xiàn)明顯的凋

8、亡峰。對(duì)照組細(xì)胞凋亡百分率為3.2±1.9％，celecoxib處理12h、24h和48h后各組細(xì)胞的凋亡百分率分別為24.5±4.3％(p＜0.01vscontrol，n=6)，52.7±5.6％(p＜0.01vscontrol，n=6)和80.6±8.2％(p＜0.01vscontrol，n=6)。 1mMindomethacin分別作用12h、24h和48h后各組細(xì)胞的凋亡百分率分別為22.6±3.5％(p＜0.01vsc

9、ontrol，n=6)，42.8±6.1％(p＜0.01vscontrol，n=6)和61.6±9.7％(p＜0.01vscontrol，n=6)。而對(duì)照組細(xì)胞凋亡百分率為3.9±1.6％。 6.100μMcelecoxib和1mMindomethacin分別處理細(xì)胞12h、24h和48h后，caspase-3酶原被激活，蛋白免疫印跡顯示17KDa的活化caspase-3片段。其作用存在時(shí)間依賴性。廣譜caspase抑制劑z-V

10、AD-fmk100μM可完全抑制celecoxib和indomethacin引起的caspase-3酶原的活化。 7.Celecoxib(10-100μM)和indomethacin(100-1200μM)分別作用24h后，細(xì)胞存活率濃度依賴性降低。預(yù)先加入廣譜caspase抑制劑z-VAD-fmk100μM可部分逆轉(zhuǎn)celecoxib和indomethacin的作用。 結(jié)論：1.COX-2并非表達(dá)于所有胃癌細(xì)胞。

11、 2.Celecoxib和indomethacin均可通過COX-2非依賴性途徑抑制胃癌細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡。 3.Celecoxib和indomethacin引起的胃癌細(xì)胞凋亡包含caspase依賴性和caspase非依賴性凋亡通路。 第二部分NSAIDs通過Akt/GSK3β/NAG-1通路誘導(dǎo)COX/2不表達(dá)胃癌細(xì)胞凋亡目的：COX-2選擇性抑制劑celecoxib和非選擇性COX抑制劑indometh

12、acin對(duì)Akt、GSK3β蛋白磷酸化水平和NAG-1蛋白表達(dá)的影響以及PI3K/Akt/GSK3β信號(hào)通路在celecoxib和indomethacin影響NAG-1蛋白表達(dá)中的作用。 方法：蛋白質(zhì)免疫印跡檢測細(xì)胞蛋白的表達(dá)，MTT法測定GSK3β抑制劑對(duì)celecoxib和indmethacin降低細(xì)胞存活率的影響。 結(jié)果：1.在MGC-803細(xì)胞未檢測到Thr308位點(diǎn)磷酸化Akt表達(dá)。選擇性COX-2抑制劑cel

13、ecoxib(100μM)和非選擇性COX抑制劑indomethacin(1mM)分別作用于MGC-803細(xì)胞3、6、12小時(shí)后，總Akt蛋白表達(dá)無明顯變化。Ser473位點(diǎn)磷酸化Akt的表達(dá)水平在3小時(shí)即明顯降低。 2.Celecoxib(100μM)和indomethacin(1mM)分別作用于MGC-803細(xì)胞3、6、12小時(shí)后，細(xì)胞總GSK3β的表達(dá)無變化。Ser9位磷酸化水平在藥物作用后3小時(shí)后開始下降，隨作用時(shí)間的延

14、長，其磷酸化水平逐漸降低。 3.10-100μMcelecoxib作用24h后，細(xì)胞存活率濃度依賴性降低。GSK3β抑制劑SB2167631μM預(yù)孵育1小時(shí)幾乎完全逆轉(zhuǎn)celecoxib降低細(xì)胞存活率的作用(Fig2-5A)。 100-1200μMindomethacin作用24h后，細(xì)胞存活率亦濃度依賴性降低。GSK3β抑制劑SB2167631μM預(yù)孵育1小時(shí)亦幾乎完全逆轉(zhuǎn)indomethacin的降低細(xì)胞存活率作用。

15、 4.MGC-803細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下即有NAG-1蛋白的表達(dá)。Celecoxib(100μM)和indomethacin(1mM)分別作用6、12小時(shí)后，NAG-1的表達(dá)水平與對(duì)照組相比明顯增加。 5.單獨(dú)應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002(20μM)和Akt抑制劑1L-6-hydroxymethyl-chiro-inositol2(R)-2-O-octadecycarbonate(10μM)作用12小時(shí)后，NAG-1蛋

16、白表達(dá)水平明顯增加。預(yù)先加入GSK3β抑制劑SB216763(10μM)孵育1小時(shí)可完全取消PI3K抑制劑和Akt抑制劑誘導(dǎo)NAG-1表達(dá)的作用。 6.PI3K抑制劑LY294002(20μM)和Akt抑制劑(10μM)預(yù)孵育1小時(shí)后再加入100μMcelecoxib或1mMindomethacin，NAG-1的表達(dá)水平與單用celecoxib或indomethacin相比無差異。而預(yù)先加入GSK3β抑制劑SB216763(10