亞硝酸鹽和銨鹽聯(lián)合暴露促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲.pdf

1、背景：隨著農(nóng)業(yè)化肥及工業(yè)防腐劑的廣泛應(yīng)用，自然界水體和土壤中氨氮及亞硝態(tài)氮的含量逐年增加。流行病學(xué)調(diào)查顯示，氨氮及亞硝態(tài)氮污染嚴(yán)重的地區(qū)，癌的發(fā)生率和死亡率逐年增高，提示亞硝酸鹽可能有致癌作用。近年來(lái)，亞硝酸鹽的致癌作用受到了質(zhì)疑，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究沒(méi)有直接的證據(jù)證明亞硝酸鹽就是致癌物質(zhì)，另外卻發(fā)現(xiàn)了其一系列藥用價(jià)值，比如降低高血壓和高血脂，保護(hù)器官缺血再灌注損傷等。許多學(xué)者因此建議將亞硝酸鹽開(kāi)發(fā)為臨床藥物。關(guān)于這個(gè)問(wèn)題，課題組認(rèn)為還需要慎重

2、。因?yàn)閬喯跛猁}的這些藥用價(jià)值是通過(guò)其在酸性缺氧環(huán)境中還原成一氧化氮而實(shí)現(xiàn)的。腫瘤細(xì)胞生活的微環(huán)境呈現(xiàn)缺氧酸性特征，另外腫瘤微環(huán)境是一個(gè)高氨環(huán)境，在這樣的微環(huán)境中，亞硝酸鹽也會(huì)還原成一氧化氮，對(duì)腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)作用。迄今為止，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)亞硝酸鹽在高氨環(huán)境中對(duì)腫瘤細(xì)胞生物作用的文獻(xiàn)。而揭示亞硝酸鹽和銨鹽共同存在的前提下，腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力會(huì)發(fā)生什么變化，對(duì)全面了解亞硝酸鹽的生物學(xué)作用有著非常重要的意義。
　　目的：探討亞硝酸鹽和銨鹽

3、聯(lián)合暴露對(duì)人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。
　　方法：實(shí)驗(yàn)分為四組，分別為空白對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組、亞硝酸鈉和氯化銨混合組。采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力，篩選出最適處理濃度及最佳處理時(shí)間；微管熒光示蹤劑觀察細(xì)胞有絲分裂相初步分析細(xì)胞增殖情況；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；線粒體示蹤劑和微絲示蹤劑熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞線粒體和微絲變化，檢測(cè)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力；比色法檢測(cè)細(xì)胞ATP含量；Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力；活性氧（R

4、OS）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平；ELISA試劑盒檢測(cè)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）的活性；Western Blot檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）的表達(dá)。
　　結(jié)果：⑴亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖活性的最適濃度和時(shí)間確定MTT結(jié)果顯示：亞硝酸鈉、氯化銨、亞硝酸鈉和氯化銨混合物（V:V=1：1）對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞的促增殖活性的最佳濃度皆為150μM，各

5、處理組促增殖活性的適宜時(shí)間為24 h，混合組與其它各組相比促增殖活性更加明顯。⑵微管示蹤劑觀察細(xì)胞有絲分裂相結(jié)果顯示：亞硝酸鈉組、氯化銨組與對(duì)照組相比細(xì)胞有絲分裂相略有增加，而混合組與對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比有絲分裂相明顯增多，混合物組比單獨(dú)應(yīng)用亞硝酸鈉有更強(qiáng)的促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖的能力。⑶亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷徙和侵襲能力劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比，混合組的相對(duì)劃痕愈合距離更大,水平運(yùn)動(dòng)能

6、力更強(qiáng)；熒光顯微鏡下可見(jiàn)混合組細(xì)胞微絲形成大量應(yīng)力纖維，有大量板狀偽足和絲狀偽足的形成，線粒體數(shù)量較其他各組增多；混合組細(xì)胞ATP含量增加明顯。Trans well細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：混合組穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比明顯增多，侵襲能力增強(qiáng)。Western blotting結(jié)果顯示：與對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組相比，混合物組MMP-2和MMP-9的表達(dá)量都明顯升高，以上各結(jié)果顯示：混合物組比單純應(yīng)用亞硝酸鈉有

7、更強(qiáng)的增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷徙和侵襲的能力。⑷亞硝酸鈉和氯化銨聯(lián)合暴露通過(guò) ROS/ODC途徑增強(qiáng)肝癌細(xì)胞遷徙和侵襲能力熒光探針DCFH-DA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果顯示：亞硝酸鈉組、氯化銨組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度比對(duì)照組稍強(qiáng)；亞硝酸鈉和氯化銨混合物組比對(duì)照組、亞硝酸鈉組、氯化銨組細(xì)胞內(nèi)ROS熒光強(qiáng)度都明顯增強(qiáng)。ELISA及Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和單純亞硝酸鹽組和氯化銨組相比，混合物組鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ODC）的表達(dá)