奧曲肽偶聯(lián)殼聚糖miR-155分子信標納米成像非小細胞肺癌的實驗研究.pdf

1、目的:
　　近年來，我國肺癌發(fā)病率呈快速增長趨勢。目前臨床上缺乏特異的、敏感的肺癌早期診斷以及治療性分子靶標。腫瘤干細胞(Cancer stem cell，CSC)被認為是腫瘤產(chǎn)生、發(fā)展、復發(fā)、轉(zhuǎn)移的根源，尋找肺癌干細胞有可能成為其早期診斷和治療的新的突破點。大量研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)廣泛參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復發(fā)、血管生成和耐藥等，識別肺癌或肺癌干細胞相關(guān)的miRNA有可能成為肺癌早期診斷的重

2、要策略。分子信標是一種分子內(nèi)互補形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)的熒光標記的寡核苷酸序列，是一個非常敏感的檢測DNA、RNA和microRNA的方法，已被廣泛用于基因定量分析、疾病診斷和活體成像等研究領(lǐng)域。殼聚糖作為一種天然陽離子多糖，被廣泛用于介導質(zhì)粒、小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)等基因轉(zhuǎn)染。體內(nèi)外實驗均證實殼聚糖納米(Chitosan，CS)可介導基因轉(zhuǎn)染，且具有較高的安全性和有效性。本課題組前期以殼聚糖納米作

3、為載體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒DNA并取得了較理想的結(jié)果。由于不同組織的高通透性和滯留效應(Enhanced permeability and retention effect，EPR)存在差距，利用納米材料的被動靶向策略通常達不到較理想的靶向效果;而腫瘤細胞表面有很多特異性的受體或抗原可以用來區(qū)分正常細胞，可以通過將納米材料表面偶聯(lián)具有特異性的多肽和單克隆抗體，使之與癌細胞表面的抗原或受體特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的靶向性診斷與治療，生長抑素受體

4、2(somatostatin receptor2，SSTR2)就是其中的代表。因此，本研究擬以非小細胞肺癌(non-small sell lungcancer，NSCLC)為疾病模型，從A549肺癌細胞系中分選CD133+CD326+雙陽性細胞并驗證其是否為肺癌干細胞（lung cancer stem cell，LCSC），而后采用分子信標(molecular beacon，MB)技術(shù)和納米技術(shù)相結(jié)合，并進行靶向多肽奧曲肽(Octreo

5、tide，OCT)偶聯(lián)，利用OCT可以與細胞表明的SSTR2受體特異性結(jié)合這一特點，通過識別肺癌細胞或肺癌干細胞中高表達的microRNA達到識別肺癌細胞或肺癌干細胞的目的，為肺癌的診斷提供新思路、新方法和新技術(shù)。
　　方法:
　　1.通過流式細胞儀從A549細胞中分選出CD133+CD326+雙陽性細胞并對其干性進行鑒定，采用熒光定量PCR方法檢測miR-155的表達。
　　2.根據(jù)miR-155序列設(shè)計并合成鎖核酸

6、修飾的miR-155分子信標(miR-155 MB)，同時設(shè)計陰性對照，即不和任何基因序列結(jié)合的隨機序列(random sequence，RS)分子信標，采用液相分子雜交實驗檢測設(shè)計的miR-155 MB和RS MB分子信標的特異性及靈敏性。
　　3.采用自組裝方法合成殼聚糖miR-155分子信標納米(CS-miR-155 MB)并對其粒徑大小、zeta電位、分散度、抗DNaseⅠ等理化性質(zhì)進行檢測。以殼聚糖納米做為載體轉(zhuǎn)染miR

7、-155MB，同時以RS MB作為陰性對照，激光共聚焦顯微鏡檢測miR-155MB對NSCLC細胞及LCSC中miR-155的識別功能并成像，并采用實時熒光定量PCR方法進行驗證，以PC-3細胞作為陽性對照;進一步在皮下移植瘤和肺移植瘤活體動物水平上檢測CS-miR-155 MB對NSCLC細胞及LCSC中miR-155的識別功能并成像。同時以商品化的脂質(zhì)體siPORT試劑作為載體轉(zhuǎn)染miR-155MB，通過檢測熒光強度和轉(zhuǎn)染效率比較殼

8、聚糖納米和脂質(zhì)體作為miR-155MB載體對miR-155的檢測及成像功能。
　　4.免疫熒光技術(shù)檢測NSCLC細胞及皮下移植瘤組織中SSTR2的表達，同時采用化學修飾方法制備靶向奧曲肽偶聯(lián)的殼聚糖分子信標納米復合物(CS-MB-OCT)并對其理化性質(zhì)進行檢測。在細胞水平上、皮下移植瘤和肺移植瘤活體動物水平上檢測CS-MB-OCT對NSCLC細胞中miR-155的識別功能并成像，并通過檢測熒光信號強度及流式細胞儀分析轉(zhuǎn)染效率來比較

9、商品化的脂質(zhì)體siPORT轉(zhuǎn)染試劑、CS-MB及CS-MB-OCT三者作為miR-155MB載體對miR-155的檢測及成像功能。
　　結(jié)果:
　　1.分選的CD133+CD326+雙陽性細胞在干細胞培養(yǎng)基中成球生長，在細胞數(shù)為1×104數(shù)量下仍具備成瘤能力，干性相關(guān)基因CD133、CD326、OCT-4、Nanog表達為A549細胞的3倍之上，miR-155的表達為A549細胞的2.63倍。
　　2.液相分子雜交實驗

10、中miR-155+miR-155MB組熒光強度為miR-155MB組的55倍，RS+RS MB組的熒光強度為RS MB組的41倍，表明設(shè)計的鎖核酸修飾的miR-155MB能夠很好的識別miR-155，具有較高的特異性和靈敏性。
　　3.按照7∶1的質(zhì)量比合成CS-MB，其粒徑范圍在15-80nm，平均粒徑31.95±3.28nm，zeta電位+20.1±2.14mv，能夠抵抗DNaseⅠ的降解;孵育細胞24小時后細胞存活率仍在90

11、％以上，適合基因轉(zhuǎn)染。在細胞水平上，CS轉(zhuǎn)染miR-155 MB后可在NSCLC細胞及LCSC細胞漿中看到較強的紅色熒光，且熒光信號強弱趨勢與熒光定量PCR檢測的miR-155的表達趨勢一致，RS MB組未檢測到熒光信號。在活體動物水平上，CS轉(zhuǎn)染miR-155 MB后能夠在NSCLC皮下移植瘤組織中檢測到較強的紅色熒光，RS MB組未檢測到熒光信號。殼聚糖納米轉(zhuǎn)染效率在各組細胞之間約為75％-85％，和商品化的siPORT脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試

12、劑相比，具有較高的熒光信號和轉(zhuǎn)染效率。
　　4.免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)SSTR2在NSCLC細胞及皮下移植瘤組織中都有表達，可作為奧曲肽特異結(jié)合的定向靶標。采用化學修飾方法以戊二醛為交聯(lián)劑合成CS-MB-OCT，其粒徑范圍為30-130 nm，平均粒徑為82.28±1.24 nm。在細胞水平上，CS-miR155 MB-OCT能夠發(fā)揮其靶向作用，和腫瘤細胞表面的SSTR2特異性結(jié)合，對NSCLC細胞中miR-155的識別功能并成像，孵育

13、時間更短，需1小時，轉(zhuǎn)染效率約為90％-95％，紅色熒光信號更強，CS-RS MB-OCT組未檢測到熒光信號。在皮下移植瘤和肺移植瘤活體動物水平上，CS-miR155 MB-OCT能夠?qū)崿F(xiàn)對NSCLC皮下移植瘤及肺移植瘤組織中腫瘤細胞的miR-155識別并成像，與CS-miR155 MB相比，熒光信號和轉(zhuǎn)染效率更高。
　　結(jié)論:
　　1.從A549細胞中分選的CD133+CD326+雙陽性細胞具有干細胞特性，并高表達miR-

14、155。設(shè)計的鎖核酸修飾的miR-155 MB能夠特異性的識別miR-155并具有較高的靈敏性。
　　2.合成的CS-miR-155 MB納米復合物能夠在細胞水平、皮下移植瘤和肺移植瘤動物水平上對NSCLC細胞或LCSC中的miR-155進行識別并成像，通過識別NSCLC細胞或LCSC中高表達的miR-155對腫瘤細胞進行成像。
　　3.和CS-miR155 MB納米復合物相比，合成的CS-miR155 MB-OCT納米復合