殼聚糖納米包裹miR-155分子信標(biāo)實(shí)時(shí)成像肺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的： 肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其總的5年生存率不足15％，嚴(yán)重威脅人類健康。有效的早期診斷方法是提高肺癌患者生存率的關(guān)鍵，基于腫瘤干細(xì)胞(cancerstemcell，CSC)理論的新策略有望為肺癌早診帶來(lái)突破。CD133是經(jīng)典的CSCs標(biāo)記物，成功用于包括腦膠質(zhì)瘤、結(jié)腸癌、腎癌、肝癌以及胰腺癌的CSCs的鑒定與分離。最近，EramoA等證實(shí)CD133是肺癌干細(xì)胞(lungcancerstemcells，LCSCs)新的

2、標(biāo)記物，為研究以LCSCs為靶標(biāo)的肺癌早期診斷策略提供了契機(jī)。此外，已有不少的研究表明：特異的微小RNA(miRNA)在維持肺上皮干細(xì)胞(lungepitheliumstemcells,LSCs)生物學(xué)特性、促進(jìn)肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要的作用，是潛在的肺癌早期診斷的分子標(biāo)簽。基于此，我們?cè)O(shè)想：基于LCSCs和miRNAs雙靶標(biāo)的檢測(cè)手段可能是更理想的肺癌早期診斷策略。因此，本實(shí)驗(yàn)擬經(jīng)Real-timePCR觀察miRNAs在CD133(

3、+)LCSCs中的表達(dá)水平差異，以期獲得CD133(+)LCSCs相關(guān)的miRNAs。 敏感的完整靶細(xì)胞內(nèi)特異性分子實(shí)時(shí)成像觀察是實(shí)現(xiàn)肺癌早期診斷的有效手段。分子信標(biāo)(molecularbeacon，MB)是根據(jù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET)原理設(shè)計(jì)的一種高靈敏性、高特異性檢測(cè)手段。較之于Real-timePCR、熒光原位雜交(fluorescenceinsi

4、tuhybridization，F(xiàn)ISH)等傳統(tǒng)的miRNAs檢測(cè)方法，分子信標(biāo)熒光技術(shù)可實(shí)現(xiàn)完整細(xì)胞內(nèi)特異性靶分子的實(shí)時(shí)成像觀察，是了解活細(xì)胞內(nèi)生物大分子相互作用的新的手段。目前，基于分子信標(biāo)技術(shù)的特異性miRNAs實(shí)時(shí)成像檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道較少。 類似于反義寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，ASO)，分子信標(biāo)活細(xì)胞內(nèi)應(yīng)用面臨生物穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)染效率低等諸多方面的困難。有研究提示用對(duì)DNA有保護(hù)作用的載體

5、并阻止分子信標(biāo)分子的核內(nèi)流是提高分子信標(biāo)穩(wěn)定性的有效的策略。在眾多的核酸載體中，殼聚糖納米顆粒(chitosannanoparticle，CS-NP)具有DNA保護(hù)作用、緩釋效應(yīng)等特性，可能是較為理想的分子信標(biāo)載體。然而，殼聚糖納米能否用作分子信標(biāo)技術(shù)的載體尚未見(jiàn)報(bào)道。 為此，本研究在分離、鑒定CD133(+)LCSCs并分析其miRNAs表達(dá)的基礎(chǔ)上，以CD133(+)LCSCs高表達(dá)的has-miR-155為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)、

6、合成靶向結(jié)合成熟miR-155及其前體的特異性分子信標(biāo)(miR-155MB)。制備miR-155分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物實(shí)時(shí)成像觀察SPC-A1肺癌細(xì)胞內(nèi)miR-155的表達(dá)，為建立實(shí)時(shí)成像CD133(+)LCSCs特異性miRNAs表達(dá)的技術(shù)平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法： 用CD133單抗觀察不同類型非小細(xì)胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)組織中的CD133(+)LCSCs。用免疫磁珠分選

7、方法自NSCLC組織富集CD133(+)LCSCs。結(jié)合文獻(xiàn)，以肺癌相關(guān)miRNA(hsa-miR-155、hsa-miR-205a、hsa-miR-191、hsa-miR-21、hsa-miR-210、hsa-miR-17-5p和hsa-miR-106a)為檢測(cè)對(duì)象，經(jīng)Real-timePCR初步篩選CD133(+)LCSCs相關(guān)miRNA。 根據(jù)成熟has-miR-155序列設(shè)計(jì)、合成特異性miR-155分子信標(biāo)。同時(shí)，設(shè)計(jì)

8、、合成不能與任何內(nèi)源性序列互補(bǔ)結(jié)合的隨機(jī)序列MB(randomsequencemolecularbeacon，RSMB)作陰性對(duì)照。液相雜交實(shí)驗(yàn)觀察miR-155分子信標(biāo)和隨機(jī)序列分子信標(biāo)的特異性和熱力學(xué)穩(wěn)定性。用miR-155分子信標(biāo)孵育丙酮固定的人NSCLC組織切片和H446、SPC-A1肺癌細(xì)胞觀察miR-155在肺癌內(nèi)的表達(dá)并經(jīng)Real-timePCR方法驗(yàn)證。同時(shí)，用Vero細(xì)胞和PC-3前列腺癌細(xì)胞作對(duì)照。 吸附法制

9、備分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物。DNaseⅠ消化實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞蛋白提取物孵育實(shí)驗(yàn)觀察分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物穩(wěn)定性。激光共聚焦觀察殼聚糖納米介導(dǎo)miR-155分子信標(biāo)轉(zhuǎn)染SPC-A1肺癌細(xì)胞及其檢測(cè)miR-155的表達(dá)能力。同時(shí)，用隨機(jī)序列分子信標(biāo)和Vero細(xì)胞作為陰性對(duì)照，評(píng)估活細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的特異性。 結(jié)果： 1、免疫熒光和流式分析發(fā)現(xiàn)12例不同類型的人NSCLC組織內(nèi)存在比例約為0.11～1.2％的CD133(+)LCSC

10、s，而正常肺組織未見(jiàn)CD133(+)細(xì)胞。免疫磁珠分選、富集CD133(+)LCSCs并經(jīng)Real-timePCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hsa-miR-17-5p、hsa-miR-155在富集的AC133(+)LCSCs中高表達(dá)，較之于AC133(-)肺癌細(xì)胞，表達(dá)上調(diào)分別為1.44、1.13倍。 2、液相雜交實(shí)驗(yàn)顯示分子信標(biāo)有很好的特異性和熱動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性。miR-155分子信標(biāo)孵育固定的NSCLC組織切片和H446、SPC-A1肺癌細(xì)胞后發(fā)

11、現(xiàn)肺癌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)特異的紅色熒光，而背景很低，陰性對(duì)照組未見(jiàn)到明顯熒光信號(hào)。Real-timePCR結(jié)果證明熒光信號(hào)來(lái)源于miR-155分子信標(biāo)與靶分子特異性結(jié)合。 3、經(jīng)吸附法制備分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物。瓊脂糖凝膠電泳和熒光屏蔽實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)Wcs-Np/WODN≥5:1時(shí)復(fù)合物結(jié)合較為完全，粒徑和Zeta電位分析顯示分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物適合于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。DNaseⅠ保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物有抗核酸酶降解作用。胞

12、漿蛋白孵育2h后裸分子信標(biāo)熒光強(qiáng)度增加約2～3倍，而核蛋白孵育裸分子信標(biāo)后熒光強(qiáng)度增加約9倍，表明胞核蛋白對(duì)裸分子信標(biāo)構(gòu)象穩(wěn)定性影響明顯。用胞核蛋白孵育分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物2h后發(fā)現(xiàn)分子信標(biāo)熒光信號(hào)無(wú)明顯增強(qiáng)，提示殼聚糖納米能有效阻止分子信標(biāo)與蛋白的非特異性結(jié)合。繼續(xù)孵育24h后熒光信號(hào)增強(qiáng)約5～6倍，顯示分子信標(biāo)殼聚糖納米復(fù)合物的緩釋效應(yīng)。進(jìn)一步用殼聚糖納米作為載體介導(dǎo)miR-155分子信標(biāo)轉(zhuǎn)染SPC-A1肺癌細(xì)胞24h后發(fā)現(xiàn)：大

13、約40～50％的SPC-A1細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)較強(qiáng)的紅色熒光，以胞漿內(nèi)較為明顯，顯示轉(zhuǎn)染效率較高，且SPC-A1細(xì)胞漿內(nèi)的熒光信號(hào)主要來(lái)源于miR-155分子信標(biāo)與其靶分子的特異性結(jié)合。核內(nèi)可見(jiàn)弱的熒光信號(hào)表明殼聚糖納米可阻止分子信標(biāo)迅速、大量在核內(nèi)聚集，用殼聚糖納米作為載體是減少分子信標(biāo)核內(nèi)非特異性信號(hào)的有效策略。 4、實(shí)時(shí)成像SPC-A1肺癌細(xì)胞移植瘤的實(shí)驗(yàn)研究正在進(jìn)行中。 結(jié)論： 1、不同類型人NSCLC組織內(nèi)存在

14、極低比例的CD133(+)LCSCs。免疫磁珠分選富集CD133(+)LCSCs并經(jīng)Real-timePCR初步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hsa-miR-17-5p、hsa-miR-155在富集的CD133(+)LCSCs中有較顯著的過(guò)表達(dá)。 2、成功設(shè)計(jì)、合成特異性miR-155分子信標(biāo)并應(yīng)用于固定的肺癌細(xì)胞內(nèi)miR-155基因表達(dá)的檢測(cè)。 3、成功用殼聚糖納米包裹分子信標(biāo)并實(shí)時(shí)成像SPC-A1肺癌細(xì)內(nèi)miR-155基因的表達(dá)，為建立實(shí)