肺炎鏈球菌PepO依賴miR-155和TLR2增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力.pdf

1、目的：了解細(xì)菌蛋白對(duì)免疫細(xì)胞的作用效應(yīng)是評(píng)價(jià)其是否能用于抵抗細(xì)菌感染的重要依據(jù)。PepO是一種細(xì)菌中保守存在的肽鏈內(nèi)切酶類蛋白，其缺陷菌株粘附和侵襲能力較野生菌株明顯減弱，是肺炎鏈球菌中一個(gè)新毒力因子。我們的研究顯示PepO有強(qiáng)烈的肺部致炎作用，但其導(dǎo)致的免疫效應(yīng)和具體機(jī)制尚不清楚。肺泡巨噬細(xì)胞在宿主防御呼吸道細(xì)菌感染中發(fā)揮著重要作用，肺部對(duì)肺炎鏈球菌的清除始于巨噬細(xì)胞，因此本研究擬以巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，探究PepO對(duì)巨噬細(xì)胞的作用效應(yīng)

2、及相關(guān)機(jī)制。
　　方法：經(jīng)典吞噬實(shí)驗(yàn)觀察PepO刺激腹腔來源的巨噬細(xì)胞后其吞噬能力的改變；Q-PCR檢測(cè)PepO誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的miR-155、SHIP1 mRNA的表達(dá)變化；Western blot檢測(cè)PepO誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的SHIP1、AKT、NF-kB蛋白表達(dá)變化；轉(zhuǎn)染miR-155的mimic或inhibitor，以過表達(dá)或降低該基因的胞內(nèi)水平，檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞噬能力改變和SHIP1 mRNA表達(dá)水平的變化；采用信號(hào)通路抑制劑

3、聯(lián)合PepO處理巨噬細(xì)胞，Q-PCR檢測(cè)miR-155的表達(dá)；采用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-155靶向SHIP1的熒光素酶活性；采用免疫熒光檢測(cè)巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬能力改變，表面受體CR3表達(dá)情況，及NF-kB核轉(zhuǎn)位的變化。
　　結(jié)果：PepO處理巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞對(duì)肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌的吞噬能力增強(qiáng)，呈劑量和時(shí)間依賴性。Q-PCR結(jié)果顯示，PepO刺激巨噬細(xì)胞后，其miRNA-155的表達(dá)較對(duì)照組顯著升高，呈劑量和時(shí)間依賴

4、性。轉(zhuǎn)染miRNA-155抑制劑的巨噬細(xì)胞，PepO處理后其吞噬細(xì)菌的能力較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的巨噬細(xì)胞顯著下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miRNA-155的 mimic巨噬細(xì)胞的吞噬細(xì)菌能力較相應(yīng)對(duì)照細(xì)胞顯著上升，提示PepO可通過誘導(dǎo)miRNA-155的表達(dá)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬能力。熒光素酶報(bào)告SHIP1基因檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA-155的細(xì)胞其熒光素酶活性較對(duì)照細(xì)胞顯著升高，證明miRNA-155的確能靶向調(diào)控SHIP1基因表達(dá)。Q-PCR和West

5、ern bloting結(jié)果顯示，PepO誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞較對(duì)照細(xì)胞的SHIP1表達(dá)顯著下調(diào)，且呈劑量和時(shí)間依賴性。而轉(zhuǎn)染miRNA-155抑制劑的巨噬細(xì)胞，PepO處理后其SHIP1的mRNA表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的巨噬細(xì)胞顯著下調(diào)，轉(zhuǎn)染miRNA-155 mimic的巨噬細(xì)胞，PepO處理后其SHIP1的mRNA表達(dá)水平較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照的巨噬細(xì)胞顯著上調(diào)，這些結(jié)果提示PepO可通過miRNA-155調(diào)控SHIP1的表達(dá)。CR3為巨噬細(xì)胞識(shí)

6、別細(xì)菌的受體之一，有文獻(xiàn)提示其表達(dá)受SHIP1的負(fù)調(diào)控，我們的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，PepO處理巨噬細(xì)胞后其CR3較陰性對(duì)照組顯著升高。這些結(jié)果提示PepO可能通過誘導(dǎo)miRNA-155下調(diào)SHIP1表達(dá)，從而促進(jìn)CR3表達(dá)增加而提高巨噬細(xì)胞的吞噬能力。將PepO分別處理TLR2缺陷小鼠來源的腹腔巨噬細(xì)胞和野生鼠的巨噬細(xì)胞，結(jié)果顯示TLR2缺陷鼠的巨噬細(xì)胞表達(dá)miRNA-155較野生鼠顯著降低，其SHIP1的表達(dá)水平不隨PepO刺激的時(shí)

7、間延長而降低，同時(shí)其CR3的表達(dá)水平也不像野生鼠的巨噬細(xì)胞，因PepO的刺激而顯著增高。抑制劑實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Akt和NF-κB的抑制劑處理細(xì)胞后， PepO刺激的miRNA-155表達(dá)較未處理組顯著下調(diào)。PepO刺激后巨噬細(xì)胞的Akt磷酸化水平顯著增高， NF-κB的含量及入核量顯著增加，而TLR2缺陷鼠的巨噬細(xì)胞在受到PepO刺激后，仍存在Akt磷酸化水平增高，但NF-κB的含量及入核量無顯著改變，這些結(jié)果提示PepO主要依賴于TLR