miR-155靶向CARHSP1參與動(dòng)脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞形成的分子機(jī)制.pdf

1、目的：通過(guò)檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿、斑塊組織以及泡沫細(xì)胞中miR-155的相對(duì)表達(dá)水平，探討miR-155參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。
　　方法：1.應(yīng)用PMA刺激THP-1分化形成巨噬細(xì)胞，隨后用ox-LDL處理，建立動(dòng)脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞模型，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（qRT-PCR）檢測(cè)泡沫細(xì)胞中與心血管疾病密切相關(guān)的7個(gè)miRNA的表達(dá)水平，篩選出升高最明顯的 miRNA；2.收集 AS患者和正常對(duì)照血漿標(biāo)本，利用

2、qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-155的相對(duì)表達(dá)水平；并收集AS患者組織斑塊和正常血管組織，檢測(cè)兩組標(biāo)本中 miR-155的相對(duì)表達(dá)差異；3.應(yīng)用 PMA刺激THP-1分化形成巨噬細(xì)胞后，用不同濃度ox-LDL處理不同時(shí)間，觀察 miR-155的表達(dá)量隨泡沫細(xì)胞沉積脂質(zhì)的量和時(shí)間變化而變化的趨勢(shì)4.應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-155的mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染泡沫細(xì)胞，應(yīng)用ELISA技術(shù)檢測(cè)炎癥因子TNF-α的含量，并用油紅O染色

3、技術(shù)檢測(cè)泡沫細(xì)胞沉積脂質(zhì)能力；5.用bioinformatics軟件Miranda、PicTar、TargetScan等預(yù)測(cè)miR-155的靶基因，并用雙luciferase reporter assay技術(shù)驗(yàn)證miR-155直接靶向CARHSP1；6.利用siRNA基因干擾技術(shù)或過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將CARHSP1 siRNA或CARHSP1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到泡沫細(xì)胞并檢測(cè) CARHSP1經(jīng)敲低或過(guò)表達(dá)后炎癥因子 TNF-α的含量和泡沫細(xì)

4、胞吞脂能力；7.利用western blot技術(shù)檢測(cè)miR-155 mimic或inhibitor轉(zhuǎn)染后，泡沫細(xì)胞中miR-155的靶基因CARHSP1及下游炎癥因子表達(dá)情況。8.應(yīng)用TRANSFAC數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果預(yù)測(cè)能與miR-155啟動(dòng)子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子及其結(jié)合位點(diǎn)，應(yīng)用ChIP方法和報(bào)告基因技術(shù)和熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子NF-κB可以轉(zhuǎn)錄調(diào)控miR-155的表達(dá)。
　　結(jié)果：1.miR-155在泡沫細(xì)胞模型中升高是最明顯的

5、；2.miR-155在AS患者血漿中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于正常對(duì)照；miR-155在AS斑塊組織中的表達(dá)量也明顯高于正常血管組織；3.miR-155在泡沫細(xì)胞中的表達(dá)量隨泡沫細(xì)胞攝食脂質(zhì)的量增多而升高，同時(shí)也隨泡沫細(xì)胞吞脂時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；4.miR-155能降低炎癥因子TNF-α的含量并且減弱泡沫細(xì)胞沉積脂質(zhì)的能力；5.Bioinformatics軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明CARHSP1是miR-155的靶向基因之一，報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證miR-15

6、5直接靶向作用CARHSP13’UTR；6.CARHSP1被抑制表達(dá)后能明顯的抑制炎癥因子 TNF-α釋放，而CARHSP1過(guò)表達(dá)能促進(jìn)炎癥因子 TNF-α釋放，其中的機(jī)制主要是CARHSP1能促進(jìn)TNF-α mRNA的穩(wěn)定性；7.在泡沫細(xì)胞中，miR-155通過(guò)直接靶向作用于 CARHSP1從而間接抑制炎癥因子 TNF-α的表達(dá)來(lái)減緩動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步削弱泡沫細(xì)胞吞脂能力；8.由炎癥因子TNF-α等刺激活化的轉(zhuǎn)錄因子NF-κ