泡沫細(xì)胞模型的建立及PPARs參與動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的研究.pdf

1、[目的]
　　 創(chuàng)傷性顱腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)后大約有2/3的患者會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)內(nèi)分泌功能障礙，而下丘腦-垂體-腎上腺(Hypothalamus-pituitary-adrenal axis，HPA)軸的損害對(duì)患者的近期死亡率和遠(yuǎn)期功能恢復(fù)有直接影響。與其他重癥疾病相比，TBI后危重病相關(guān)皮質(zhì)類固醇不足(Critical Illness-Related CorticosteroidInsuff

2、iciency，CIRCI)的發(fā)生情況及、發(fā)病機(jī)理及糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GCs)替代治療有著其自身特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠顱腦液壓創(chuàng)傷(Fluid percussioninjury，F(xiàn)PI)后急性期CIRCI的發(fā)生、HPA軸的病理改變以及不同劑量甲基強(qiáng)的松龍(Methylprednisolone，MP)的替代治療應(yīng)用來探討TBI后急性期CIRCI的發(fā)生情況及發(fā)病機(jī)理以及評(píng)價(jià)MP的治療時(shí)機(jī)及作用。
　　 [

3、材料與方法]
　　 健康成年雄性Wistar大鼠220只(體重300-350g，鼠齡8周)，隨機(jī)分為正常對(duì)照(naive)組(n=16)、創(chuàng)傷對(duì)照(injury control)組(n=55)、小劑量MP治療(Low-dose MP Treatment)組(n=55)和大劑量MP治療(High-dose MP Treatment)組(n=94)。TBI模型建立：在顱骨前囟后4.4mm，矢狀縫側(cè)方2.4mm鉆直徑4mm的骨孔，應(yīng)用

4、大鼠液壓打擊儀(Fluid-Percussion injury，F(xiàn)PI)以2.0～2.5 atm的打擊力度致傷。造模成功后對(duì)小劑量MP治療組和大劑量MP治療組行腹腔注射甲基強(qiáng)的松龍(小劑量5mg/kg，大劑量30mg/kg)，連續(xù)4天給藥，創(chuàng)傷對(duì)照在相同時(shí)間給予相同體積的0.9％的生理鹽水，給藥方法同上。除正常對(duì)照組外，其余三組隨機(jī)取15只大鼠分別于打擊前7天、打擊后7天及打擊后14天給予電擊刺激，并分別于電擊前30分鐘、電擊后30分鐘

5、、90分鐘、24小時(shí)行內(nèi)眥靜脈球后靜脈叢取血，用ELISA法測(cè)定其中皮質(zhì)酮水平，以反映正常狀態(tài)及顱腦創(chuàng)傷后大鼠的應(yīng)激反應(yīng)功能變化，計(jì)算皮質(zhì)酮增幅指數(shù)(corticosterone increaseindex，CII)，CII<2.5定義為CIRCI。于創(chuàng)傷后7天、14天在各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)取大鼠10只，10％水合氯醛(3ml/kg)麻醉，心臟灌注，斷頭，取腦及垂體后于4％多聚甲醛固定24小時(shí)，做冠狀切面，修成厚約3mm的冠狀切片，石蠟包埋，切

6、片，用于HE、凋亡及免疫組織化學(xué)染色。各實(shí)驗(yàn)組于第7天及14天另隨機(jī)取6只大鼠麻醉，2.5％戊二醛灌注，斷頭取腦，將下丘腦室旁核區(qū)腦組織切成1mm×1mm×1mm的小塊，并放入4℃的2.5％戊二醛中固定2小時(shí)后冷PBS沖洗，最后浸于PBS中4℃保存。經(jīng)漂洗、鋨酸固定、脫水后包埋、光鏡下定位后，切片，做透射電鏡觀察。
　　 [結(jié)果]
　　 1.創(chuàng)傷對(duì)照組及不同劑量MP治療組大鼠的死亡率為10～55％，其中大劑量甲強(qiáng)龍治療組

7、死亡率為55％，明顯高于創(chuàng)傷對(duì)照(16.7％)與小劑量治療組(10％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 2.FPI前7天各實(shí)驗(yàn)組大鼠電刺激后血皮質(zhì)酮增幅指數(shù)并無差別；液壓打擊后7天，大劑量MP治療組CII與小劑量MP治療組和創(chuàng)傷對(duì)照組相比明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，CIRCI的發(fā)生率明顯升高，而小劑量組和創(chuàng)傷組相比較無差別；液壓打擊后14天，各組大鼠CII差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；第7-14天死亡的大鼠與14天

8、后存活大鼠于打擊后7天測(cè)得的CII相比，明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。
　　 3.對(duì)正常對(duì)照組大鼠石蠟切片行TUNEL原位凋亡染色，罕見凋亡細(xì)胞。打擊后從第3天開始出現(xiàn)凋亡的室旁核神經(jīng)元，7天達(dá)到高峰。大劑量甲強(qiáng)龍治療組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)創(chuàng)傷對(duì)照組和小劑量甲強(qiáng)龍治療組(與創(chuàng)傷對(duì)照組相比：P<0.05；與小劑量甲強(qiáng)龍相比：P<0.05)。7天以后凋亡細(xì)胞數(shù)開始逐漸減少，到第14天，各實(shí)驗(yàn)組存活大鼠問差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

9、。在7天、14天于存活大鼠垂體切片中均未檢測(cè)到凋亡細(xì)胞，但在尸檢中確發(fā)現(xiàn)有垂體細(xì)胞凋亡。
　　 4.液壓打擊后行下丘腦CRH免疫組織化學(xué)染色顯示，第7天大劑量甲基強(qiáng)的松龍治療組CRH細(xì)胞明顯減少(與創(chuàng)傷對(duì)照組相比：P<0.05；與小劑量甲強(qiáng)龍相比：P<0.05)。
　　 5.透射電鏡結(jié)果發(fā)現(xiàn)FPI后7天下丘腦室旁核神經(jīng)元發(fā)生了兩種細(xì)胞死亡方式-凋亡與壞死。
　　 [結(jié)論]
　　 1.液壓打擊顱腦損傷后大鼠

10、下丘腦及垂體由于受到原發(fā)性機(jī)械損傷及繼發(fā)性損害，下丘腦室旁核CRH細(xì)胞出現(xiàn)一定數(shù)量的凋亡，而大劑量MP的應(yīng)用增加了凋亡細(xì)胞的數(shù)量。
　　 2.液壓打擊顱腦損傷后部分大鼠由于下丘腦及垂體的損傷出現(xiàn)了應(yīng)激反應(yīng)障礙，造成了大鼠應(yīng)激時(shí)血皮質(zhì)酮增長倍數(shù)下降，導(dǎo)致CIRCI的發(fā)生。大劑量MP治療不僅沒有提高腦創(chuàng)傷后大鼠的生存質(zhì)量，反而加重了下丘腦損傷的嚴(yán)重程度，提高了創(chuàng)傷后應(yīng)激不良的發(fā)生率。
　　 3.液壓打擊顱腦損傷后大劑量MP的