乳腺癌雌激素受體細(xì)胞定位臨床病理意義的研究.pdf

1、背景:乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響患者的健康及生存。尋找乳腺癌預(yù)后危險因素及潛在的治療靶點，是當(dāng)前乳腺癌研究熱點之一。乳腺癌屬激素依賴性腫瘤，體內(nèi)雌激素水平是調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖的重要因素，雌激素主要通過雌激素受體(Estrogen receptor，ER)發(fā)揮作用。雌激素與ER形成復(fù)合體后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用。這種機(jī)制稱為雌激素的基因組作用模式或核啟動的雌激素應(yīng)答。但近年來研究已

2、經(jīng)證實，雌激素還存在非基因組作用模式，也稱為膜啟動的雌激素應(yīng)答，在這種模式中，雌激素直接與分布在細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的雌激素結(jié)合蛋白結(jié)合，快速激活細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，主要包括ERK/MAPK信號通路、Ras-PI3K通路、JNK通路及第二信使系統(tǒng)等，使細(xì)胞產(chǎn)生快速反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生增殖及惡性轉(zhuǎn)化。關(guān)于分布在癌細(xì)胞質(zhì)/膜中的雌激素結(jié)合蛋白究竟為何種成分，目前尚無定論。
　　目前在臨床上廣泛使用免疫組化法檢測乳腺癌細(xì)胞的ER狀態(tài)，普遍認(rèn)為

3、ERα蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，而質(zhì)/膜ERα由于其成分尚無定論，臨床意義不明，目前尚未引起廣泛關(guān)注。本課題組在前期工作中發(fā)現(xiàn)，部分乳腺癌病例ERα免疫組化染色可見不同程度、不同比例的細(xì)胞質(zhì)/膜著色，目前尚不清楚這些定位于細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)中的蛋白究竟是何種成分以及這種蛋白具有何種臨床意義。我們推測該蛋白可能為ERα66的剪切變異體:ERα36。目前，該蛋白在乳腺癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用及其對相關(guān)治療藥物療效的影響及機(jī)制尚未明確。
　　目的

4、:1、研究ERα蛋白在人乳腺癌組織中的定位，確定是否存在細(xì)胞質(zhì)/膜定位，探討細(xì)胞質(zhì)/膜ERα表達(dá)的臨床病理意義及其對患者預(yù)后的影響。2、研究乳腺癌病例中質(zhì)/膜ERα表達(dá)與ERα36表達(dá)及定位之間的關(guān)系，探討質(zhì)/膜ERα究竟為何種蛋白。3、研究ERα36高表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞系中ERα蛋白細(xì)胞內(nèi)定位情況以及HER-2、RARα、ki-67蛋白表達(dá)量的變化，探討ERα36促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移可能的作用機(jī)制。
　　方法:1、免疫組化染色

5、法檢測ERα蛋白表達(dá)量及細(xì)胞內(nèi)定位，以＞1％腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)確切的細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)/膜不同強(qiáng)度的黃色細(xì)顆粒狀著色計為ER核陽性或質(zhì)/膜陽性。統(tǒng)計分析質(zhì)/膜ERα蛋白與患者的月經(jīng)狀態(tài)、家族史、乳頭大導(dǎo)管受累、乳腺癌組織學(xué)分級、臨床分期、T分期、N分期、M分期、復(fù)發(fā)、HER-2表達(dá)等臨床病理特征之間的相關(guān)性。2、應(yīng)用q-PCR方法檢測36例人乳腺癌新鮮標(biāo)本中ERα36、ERα66mRNA表達(dá)量，分析二者與ERα核定位及質(zhì)/膜定位的相關(guān)性;3、

6、應(yīng)用核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒分別提取癌細(xì)胞的核蛋白和質(zhì)/膜蛋白，得到高純度的核蛋白和質(zhì)/膜蛋白，用Western-blot方法分別在核蛋白樣本及質(zhì)/膜蛋白樣本中檢測ERα36和ERα66蛋白的表達(dá)情況，并對Western蛋白條帶掃描，進(jìn)行灰度分析和計算，分析ERα36和ERα66在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。4、構(gòu)建pIRES2-EGFP-ERα36基因過表達(dá)載體，瞬時轉(zhuǎn)染至人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，提取mRNA和蛋白質(zhì)，分別應(yīng)用q-PCR和

7、Western-blot方法鑒定ERα36和ERα66表達(dá)情況。5、收集轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞，制作細(xì)胞蠟塊，免疫組化方法檢測ERα、HER-2及ki-67的表達(dá)。6、收集轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞，提取總蛋白，Western-blot方法檢測HER-2、RARα蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1、在1164個病例中， ERα免疫組化染色陽性定位主要位于細(xì)胞核，部分病例可觀察到細(xì)胞質(zhì)/膜部位著色，質(zhì)/膜著色可以與核著色同時出現(xiàn)（即核、質(zhì)/膜均陽性）

8、，也可以單獨出現(xiàn)（質(zhì)/膜陽性，核陰性）。ERα質(zhì)/膜著色與較高的N分期、較高的HER-2評分及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，ERα質(zhì)/膜陽性患者無進(jìn)展生存期較短。2、36例樣本中共有18例（占50.0％）檢測到ERα66和/或ERα36 mRNA，其中10例檢測到ERα66mRNA，陽性百分比為27.8％;14例檢測到ERα36 mRNA，陽性百分比為38.9％。ERα66與ERα36共同表達(dá)的樣本共6例，占所有樣本的百分比為16.7％。ERα66 m

9、RNA陽性的病例均出現(xiàn)免疫組化核著色，ERα36mRNA陽性病例除1例以外免疫組化染色均出現(xiàn)ERα細(xì)胞質(zhì)/膜著色。ERα66、ERα36 mRNA表達(dá)量分別與ERα免疫組化核定位及質(zhì)膜定位有顯著的相關(guān)性(p＜0.05)。3、免疫組化ERα核及質(zhì)/膜均陽性者Westernblot顯示ERα36和ERα66蛋白均有表達(dá);ERα核陽性者多數(shù)為ERα66蛋白表達(dá)，少數(shù)為ERα36表達(dá);ERα質(zhì)/膜陽性者僅有ERα36蛋白表達(dá);ERα核及質(zhì)/膜均

10、陰性者ERα36和ERα66蛋白均未見表達(dá)。4、pIRES2-EGFP-ERα36真核表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72小時后，轉(zhuǎn)染效率約為70％。qPCR檢測結(jié)果顯示，ERα36基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后，ERα36基因過表達(dá)129.23倍;western-blot檢測到特異性ERα36條帶，兩種結(jié)果均證實轉(zhuǎn)染成功。5、轉(zhuǎn)染后MCF-7細(xì)胞ERα著色部位變化，除核表達(dá)之外，細(xì)胞質(zhì)/膜中也可見陽性著色，進(jìn)一步證實ERα3

11、6主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜;HER-2蛋白表達(dá)增加，部分腫瘤細(xì)胞胞膜出現(xiàn)陽性著色(1+～2+);ki-67指數(shù)增高。6、轉(zhuǎn)染72小時后，pIRES2-EGFP-ERα36與pIRES2-EGFP-NC相比，HER-2蛋白表達(dá)量增加，而RARα蛋白表達(dá)減少。
　　結(jié)論:1、人乳腺癌雌激素受體α(ERα)蛋白表達(dá)定位于癌細(xì)胞核和/或細(xì)胞質(zhì)/膜中。質(zhì)/膜ERα主要為ERα36，核ERα主要為ERα66，少部分為ERα36。2、乳腺癌細(xì)胞