TWIST表觀遺傳抑制雌激素受體α表達(dá)的分子機(jī)制及乳腺癌臨床意義.pdf

1、目的:探討與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子TWIST與雌激素受體α(ERα)之間分子水平和功能上的調(diào)控關(guān)系及乳腺癌臨床意義。
　　方法:首先,構(gòu)建了pcDNA5-TWIST穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系;其次,為了鑒定出人類基因組中潛在的TWIST結(jié)合位點(diǎn),我們用HEK293-TWIST細(xì)胞系和陰性對照的HEK293細(xì)胞系來進(jìn)行ChIP測序分析;然后,為了檢驗(yàn)表達(dá)HEK293-TWIST的細(xì)胞中NuRD復(fù)合物的各組分是否也被募集到ESR1基因上的TW

2、IST結(jié)合部位,我們相繼作了ChIP和ChIP-re-ChIP實(shí)驗(yàn)分析;再次,為了確定乳腺癌細(xì)胞系中TWIST與ERα的表達(dá)關(guān)系,我們通過RT-PCR和Westernblot方法,分析檢測了5個(gè)不同類型的乳腺癌細(xì)胞系中ESR1(ERα基因)的mRNA和蛋白質(zhì)水平;還有,為了檢測ESR1基因上與TWIST/NuRD的相關(guān)區(qū)域是否具有抑制ESR1基因轉(zhuǎn)錄的功能,我們完成了如下實(shí)驗(yàn):1、我們完成了熒光素報(bào)告基因分析技術(shù);2、為了檢測外源性TW

3、IST的表達(dá)是否抑制內(nèi)源性ERα的表達(dá),我們在乳腺癌細(xì)胞中做了TWIST的RNA干擾技術(shù)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)技術(shù),使TWIST基因沉默和過表達(dá)進(jìn)行分析;最后,為了檢測人類乳腺癌患者中TWIST與ERα表達(dá)的關(guān)系及可能的臨床意義,我們收集了28例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者的腫瘤組織,抽提mRNA用半定量RT-PCR和用免疫組織化學(xué)方法檢測了TWIST和ERα的mRNA和蛋白質(zhì)水平。
　　結(jié)果:建立了HEK293-TWIST細(xì)胞系及其陰性對照的

4、HEK293細(xì)胞系;應(yīng)用該細(xì)胞系,進(jìn)行ChIP測序分析,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)位于人類ERα基因(ESR1)內(nèi)含子7上的與TWIST結(jié)合的關(guān)鍵DNA區(qū)域;再通過ChIP-re-ChIP實(shí)驗(yàn),揭示了HEK293-TWIST細(xì)胞系中的ESR1基因上的TWIST結(jié)合位點(diǎn)上與TWIST結(jié)合的NuRD復(fù)合物重要組分Mi-2,MTA2和HDAC2均結(jié)合到人類ERα基因(ESR1)內(nèi)含子7上的關(guān)鍵DNA區(qū)域。這說明了TWIST可以有效地將NuRD復(fù)合物募集到ES

5、R1基因上的TWIST結(jié)合區(qū)域;在高侵襲性的ERα表達(dá)陰性的SUM1315、MDA-MB-435和MDA-MB-231細(xì)胞系中,用RT-PCR和Westernblot檢測出高水平的TWISTmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá),而在低侵襲性且高表達(dá)ERα的T47D和MCF-7細(xì)胞系中沒有檢測出TWIST的mRNA和蛋白質(zhì)水平。在熒光素報(bào)告基因分析實(shí)驗(yàn)中,我們將TWIST結(jié)合的關(guān)鍵DNA區(qū)域克隆到pGL3-Pro-Luc報(bào)告基因上而構(gòu)建成pGL3-332

6、ESR1-Pro-Luc報(bào)告基因,再將pGL3-332ESR1-Pro-Luc報(bào)告基因質(zhì)粒和TWIST表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的TWIST顯著地抑制了這個(gè)報(bào)告基因的活性,而對照組將pGL3-Pro-Luc和TWIST共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中,TWIST的過表達(dá)并沒有抑制對照組中pGL3-Pro-Luc這個(gè)報(bào)告基因的熒光素酶活性。顯示ESR1基因上的TWIST/NuRD的相關(guān)區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄抑制功能;在TWIST的RNA干擾和細(xì)

7、胞轉(zhuǎn)染過表達(dá)中,我們的分析揭示了在MDA-MB-435和4T1細(xì)胞系中使TWIST基因沉默,ERα的mRNA表達(dá)提高了2.5-3倍;在T47D細(xì)胞系中過表達(dá)TWIST,抑制了ERα的mRNA的表達(dá);在MCF-7細(xì)胞系中過表達(dá)TWIST,降低了細(xì)胞中的ERα的蛋白表達(dá)水平,說明TWIST能抑制ERα的表達(dá);HDAC抑制劑—TSA,或者基因沉默TWIST均能夠解除TWIST的抑制作用。最后,我們收集28例侵襲性乳腺癌組織進(jìn)行RT-PCR和免

8、疫組化實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)有17位(61％)腫瘤患者具有TWIST的mRNA與蛋白高水平的表達(dá)而ERα的mRNA和蛋白低水平表達(dá)或無法檢測到,7位(25%)腫瘤患者具有TWIST的mRNA和蛋白質(zhì)低水平表達(dá)或者無法檢測到而ERα的mRNA和蛋白質(zhì)呈現(xiàn)高水平表達(dá),2位(7%)腫瘤患者中TWIST和ERα的mRNA,蛋白質(zhì)水平都增高,另2位(7%)腫瘤患者TWIST和ERα的mRNA,蛋白質(zhì)水平都降低。這些結(jié)果顯示在86%的侵襲性乳腺癌中,TWIST

9、的表達(dá)與ERα表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:揭示了TWIST表觀遺傳學(xué)抑制ERα表達(dá)的分子機(jī)制;在TWIST表達(dá)陽性的乳腺癌細(xì)胞中,TWIST通過招募NuRD復(fù)合物,從而抑制了ERα的表達(dá);TWIST表達(dá)與ERα的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān);ERα在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和抑制是一個(gè)可逆的過程。在這些ERα表達(dá)被抑制的乳腺癌細(xì)胞中我們使用HDAC抑制劑—TSA,或者基因沉默TWIST而重新恢復(fù)ERα表達(dá),可望在臨床上治療乳腺癌患者時(shí),可能恢復(fù)乳腺癌