豬過敏毒素C5a的DNA適配體篩選和評價.pdf

1、過敏毒素C5a是補體系統(tǒng)級聯活化過程中產生的一個小片段蛋白，釋放到血液中，具有免疫調節(jié)作用。同時，C5a也是重要的前炎癥性介質，與炎癥反應的發(fā)生、發(fā)展密切相關。C5aR廣泛分布在髓樣細胞表面，C5a與細胞表面C5aR結合，釋放組織胺、血管活化因子、自由基及白細胞介素IL-6、IL-8等，導致平滑肌收縮、血管通透性增加。此外，高濃度的C5a是中性粒細胞、嗜酸粒細胞和單核細胞的趨化劑,可誘導細胞順濃度梯度方向移動。機體出現炎癥時，血液中的C

2、5a濃度增加，引起PMN在血管內皮位置聚集，進而穿過內皮向組織浸潤，誘導產生并釋放大量的炎癥介質，導致血管內功能不全，使炎癥加重。研究證實過敏毒素C5a在機體許多疾病的病理過程中參與炎癥的發(fā)生和發(fā)展，所以研究炎癥介質C5a不僅對揭示炎癥反應過程中的分子機制有重要的意義，而且對于尋求、開發(fā)有效的C5a拮抗劑控制其在免疫應答和炎癥反應等病理過程中的作用，對于多種炎性疾病的治療和轉歸具有重大臨床價值，而研發(fā)豬C5a適配體拮抗劑作為新型養(yǎng)殖動物

3、廣譜抗炎藥在獸醫(yī)領域同樣具有重大影響。
　　諸多研究者意識到用阻斷C5a與其受體（C5aR/CD88）結合的方法抑制炎癥反應是極具臨床應用前景的抗炎新途徑，然而抗體類抑制劑制備難度大、成本高、反復使用容易使機體出現過敏反應等，探索與抗C5a抗體作用原理相似，而且更加便宜、安全、活性穩(wěn)定的拮抗劑成為抗炎新思路。適配體是一類能特異性地與各類生物靶標以高親和力相結合的單鏈DNA或RNA，作用原理類似于抗體，通過兩者結合從而抑制受體靶標的

4、生物活性，另外適配體易制備易修飾的獨特優(yōu)勢可彌補C5a抗體在臨床治療上的缺陷，適配體最大的優(yōu)點是沒有免疫原性，故在臨床用藥時能重復使用；隨著適配體在醫(yī)學，生命科學等領域的研究和在疾病的診斷與治療上的應用，拮抗C5a活性適配體的篩選也成為了研究的熱點，因此，為了開發(fā)探索豬炎癥性疾病新型廣譜治療藥物，篩選豬C5a的核酸適配體是非常有必要的。
　　本論文采用毛細管電泳篩選策略，以豬C5a為靶標進行單鏈DNA適配體的篩選；并且對篩選得到的

5、適配體的親和力和拮抗活性進行了考察。研究內容主要包括：
　　（1）原核表達豬C5a蛋白。試驗內容：①將豬C5a蛋白基因分別克隆入pET32a和pET28a表達載體中，構建重組質粒pET32 a-C5a和pET28a-C5a，轉化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌落，提取重組質粒，進行一系列鑒定；②以SDS-PAGE及western blotting等方法鑒定重組質粒是否成功表達豬C5a蛋白。③將鑒定正確的菌株大量

6、培養(yǎng)，進行IPTG誘導表達。④利用銅柱親和層析技術純化含有組氨酸標簽的目的蛋白。⑤利用豬中性粒細胞趨化及誘導試驗鑒定目的蛋白的生物活性。
　?。?）豬C5a的單鏈DNA適配體篩選和評價。①將具有生物活性的重組豬C5a蛋白作為靶標，選用基于CE的高效分離能力的CE-SELEX技術，將未結合序列與結合復合物分離，經過六輪篩選，最終獲得能與該蛋白具有較高結合力的DNA適配體序列組。②以高通量測序和生物信息學技術進行候選適配體的結構解析；

7、③通過EMSA和SPR技術測定適配體與C5a蛋白結合的親和力和特異性；④最后利用體外細胞趨化試驗和流式細胞技術檢測適配體S1拮抗豬C5a生物活性的能力。
　　通過上述兩大部分試驗，獲得了以下結果：
　?。?）成功構建了pET32a-C5a和pET28a-C5a兩株重組表達質粒，轉染大腸桿菌BL21后優(yōu)化其誘導條件，成功獲得了大量表達豬C5a蛋白的菌株，通過銅柱親和層析純化蛋白，SDS-PAGE和western-blottin

8、g檢測分析表明，重組豬C5a蛋白獲得表達，重組蛋白大小為10,000，純化后豬C5a蛋白經質譜鑒定，其一級結構正確，純度達到90％以上，濃度為2.5g/L。體外細胞試驗檢測到C5a具有趨化和誘導中性粒細胞的活性，為下一步大量純化豬C5a蛋白用于適配體篩選奠定了基礎。
　?。?）豬C5a單鏈DNA適配體的篩選結果顯示，經過六輪篩選，從毛細管電泳峰圖上可以看出靶標蛋白與核酸復合物峰圖，候選序列高通量測序獲得55000多條序列，序列統(tǒng)計

9、比對分析后挑選出的六條代表序列與C5a親和力測定，適配體S1顯示出高親和力和結合特異性，KD值為4.81μM。通過體外中性粒細胞趨化試驗，發(fā)現適配體S1和S2均可以抑制豬C5a的趨化活性，流式細胞試驗結果得出適配體S1能夠抑制C5a與豬中性粒細胞表面C5aR的結合，從而抑制其活性作用。
　　通過以上結果，得出如下4條結論：
　　（1）成功構建了pET32a-C5a和pET28 a-C5a兩株豬C5a蛋白基因的原核表達系統(tǒng)，純

10、化獲得的豬C5a蛋白經質譜鑒定，其一級結構正確，體外細胞試驗證明其具有生物活性，為下一步適配體篩選奠定了基礎。
　?。?）建立了篩選豬C5a核酸適配體的高效篩選條件；CE-SELEX技術結合高通量測序和SPR技術，針對豬C5a蛋白快速高效的篩選到特異性結合的適配體。
　?。?）初步建立適配體高通量測序大數據的分析流程，不僅提高了篩選效率，而且避免了傳統(tǒng)LTS單點測序，可能錯失更優(yōu)適配體的缺點。本試驗通過序列分析軟件，將大數據

11、統(tǒng)計分類，更有目標性的挑選候選適配體。
　?。?）體外細胞趨化試驗中，適配體S1和S2均可有效抑制C5a誘導的豬中性粒細胞的趨化，拮抗能力相比，S1比S2強，更有治療豬C5a介導的炎性疾病的潛力。
　　論文創(chuàng)新點：
　　1.首次通過原核表達獲得有活性的豬C5a蛋白，在獸醫(yī)領域為深入研究C5a致炎機理奠定基礎，同時為其拮抗劑的研發(fā)提供條件。
　　2.建立了毛細管篩選技術，用于豬C5a適配體的高效篩選，并獲得了能夠體