人C5a受體衍生肽的篩選及其功能的初步研究.pdf

1、過敏毒素C5a是補(bǔ)體系統(tǒng)活化產(chǎn)物，也可由一些吞噬性細(xì)胞產(chǎn)生，它是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)和趨化因子，在急性肺損傷、膿毒血癥、腦膜炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腎小球腎炎等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。因此，抑制C5a的生物學(xué)活性對于以上炎性疾病的治療與預(yù)防有著重要的意義。 目前的C5a抑制劑大多以C5a受體(CD88)為靶位，通過與C5a競爭性結(jié)合CD88而達(dá)到抑制C5a生物活性的目的。本研究關(guān)注C5a受體上同C5a結(jié)合的關(guān)鍵位點，從中篩

2、選既能直接和配體C5a結(jié)合，又能拮抗配體C5a生物活性的新型C5a抑制劑，并在此基礎(chǔ)上，對其功能作了初步研究。本研究由3個部分組成： 第一部分：C5a結(jié)合肽的篩選 利用噬菌體展示肽庫技術(shù)，首先從噬菌體展示十二肽庫篩選陽性克隆，以rhC5a為包被靶分子，將噬菌體展示十二肽庫與包被有靶分子的平板共溫育，先洗去未結(jié)合的噬菌體，然后洗脫與rhC5a特異性結(jié)合的噬菌體，將洗脫下來的rhC5a特異性結(jié)合的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，再進(jìn)行下

3、一輪的結(jié)合/擴(kuò)增循環(huán)，以富集那些可結(jié)合序列。 3次重復(fù)以上過程，測序所得陽性克隆，從而得到其氨基酸序列。我們從噬菌體展示十二肽庫得到的陽性克隆中隨機(jī)挑取151克隆進(jìn)行測序鑒定。 為了更精確地確認(rèn)C5a與其受體的結(jié)合位點，期望找到更精細(xì)的拮抗多肽，同時考慮環(huán)化肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，針對噬菌體展示十二肽庫的實驗結(jié)果，本研究又以上述相同的方法，從受限于二硫鍵環(huán)內(nèi)的噬菌體展示七肽庫篩選陽性克隆，同樣以rhC5a為包被靶分子，從受限

4、于二硫鍵環(huán)內(nèi)的噬菌體展示七肽庫中我們共挑取138陽性克隆并測序鑒定。 第二部分：C5a受體衍生肽的確定 應(yīng)用軟件VectorNTISuite9對以上得到的多肽序列同C5a受體(分別是CD88、C5L2)氨基酸序列進(jìn)行比對，分析其與C5a受體匹配區(qū)域的同源性，從高同源性序列中得到的一系列多肽，我們定義為C5a受體衍生肽。 運用EXPASY工具，分析C5L2的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)合陽性克隆比對結(jié)果，我們分析了C5L2與

5、其配體C5a結(jié)合位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：C5L2受體第5-21，第31-52，第71-80，第86-103位，第107-120位，第159-180位，第245-265位，第278-293位序列是結(jié)合C5a的高親和力區(qū)域。 第三部分C5a受體衍生肽功能的初步研究 根據(jù)陽性克隆與CD88分子的比對結(jié)果，從中隨機(jī)挑選10個不同的C5a受體衍生肽序列，在431-A型自動多肽儀上合成；應(yīng)用生物傳感器技術(shù)，以rhC5a包被傳感器作為固定

6、相，將這些衍生肽作為流動相，檢測rhC5a與C5aR衍生肽的結(jié)合力，得到了兩條衍生肽L5、C5，它們和rhC5a具有較強(qiáng)的結(jié)合力，其Kd分別為：6.697×10-6M，8.333×10-4M。 采用LPS致死量的小鼠休克模型，研究C5a受體衍生肽在小鼠體內(nèi)拮抗C5a的活性，觀察它們分別對小鼠的保護(hù)作用。將21只Balb/c小鼠隨機(jī)分為衍生肽L5治療組、衍生肽C5治療組和對照組，每組7只，觀察小鼠48小時生存率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：治療組