TNFα、C3a、C5a上調(diào)D407細(xì)胞系VEGF表達(dá)轉(zhuǎn)錄途徑的初步研究.pdf

1、目的：初步確定TNF α、C3a、C5a上調(diào)D407 VEGF表達(dá)的時(shí)相、劑量反應(yīng)關(guān)系，進(jìn)一步探討NF-k B轉(zhuǎn)錄因子跟VEGF表達(dá)上調(diào)的關(guān)系。 方法： 第一部分：分別用1500U/ml TNF α、100ng/ml C3a、100ng/mlC5a刺激D407細(xì)胞，每種刺激物分別刺激8hrs、16hrs、24hrs后，收取細(xì)胞上清和細(xì)胞，用ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清VEGF濃度，用RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞VEGF mRNA相

2、對(duì)水平。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)立對(duì)照組。 第二部分：實(shí)驗(yàn)分為無預(yù)處理組和PDTC預(yù)處理組(預(yù)處理組在加入刺激物之前用100μM PDTC預(yù)處理30min)。在每組里，分別用不同濃度的TNF α(1500、3000 U/ml)、C3a(100、300、500ng/ml)、C5a(100、300、500ng/ml)刺激細(xì)胞24hrs后，收取細(xì)胞上清，用ELISA法測(cè)細(xì)胞上清VEGF濃度。每組均設(shè)置對(duì)照組。 第三部分：分別用不同濃度的

3、TNF α(1500、3000 //ml)、C3a(100、300、500ng/ml)、C5a(100、300、500ng/ml)刺激細(xì)胞30min，用免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)P65的分布；用PDTC預(yù)處理后，分別用1500、3000 U/mlTNF α刺激細(xì)胞30min，用免疫熒光法檢測(cè)P65。基礎(chǔ)狀態(tài)下免疫熒光為對(duì)照。 結(jié)果： 第一部分：ELISA：用TNF α、C3a、C5a刺激8hrs時(shí)，C3a組比對(duì)照組高(19.6

4、％)，而TNF α、C5a組較對(duì)照組低(分別低16.6％和24.5％)；刺激16hrs時(shí)，TNFα、C3a組明顯高于對(duì)照組(分別高56.4％和47.4％)，C5a組比對(duì)照組略高(3.6％)；24hrs時(shí)，TNFα、C3a、C5a比對(duì)照組增高的幅度進(jìn)一步增大(分別為83.7％、57.9％、8.4％)。RT-PCR：刺激8hrs時(shí)，C3a組VEGF mRNA的表達(dá)較對(duì)照組高，TNF α組較對(duì)照組低，C5a組跟對(duì)照組差別不大；16hrs時(shí)，T

5、NF α、C3a組明顯比對(duì)照組高，C5a組比對(duì)照組略高；24hrs時(shí)，對(duì)照組和TNF α組不能檢測(cè)到表達(dá)，但C3a組仍有較強(qiáng)的表達(dá)，C5a組有低水平表達(dá)。 第二部分：不同濃度TNF α、C3a、C5a刺激D407細(xì)胞24hrs后，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞上清VEGF濃度均比對(duì)照組高：其中，TNF α組比對(duì)照組高43.1％-57.4％，1500U/ml濃度時(shí)增加較明顯；C3a組比對(duì)照組高17.3％-32.1％，300ng/ml濃度時(shí)增加最明顯

6、；C5a組比對(duì)照組高14.7％-31.8％，300ng/ml濃度最明顯；PDTC預(yù)處理可以部分抑制TNFQ和C5a對(duì)VEGF分泌水平的上調(diào)，但對(duì)于C3a組，PDTC預(yù)處理反而進(jìn)一步增加了VEGF的分泌水平。 第三部分：1500U/ml、3000 U/ml TNFQ刺激30 min后，NF-K B P65發(fā)生核轉(zhuǎn)移，100 μ M PDTC預(yù)處理30min可以抑制其核轉(zhuǎn)移；不同濃度C3a(100、300、500ng/ml)、C5a