SELEX技術(shù)篩選金黃色葡萄球菌毒性休克綜合征毒素-1適配體及其功能研究.pdf

1、目的:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)分泌的毒性休克綜合征毒素-1(Toxic Shock Syndrome Toxin-1，TSST-1)引發(fā)中毒性休克綜合征(Toxic ShockSyndrome，TSS)，通過激活T淋巴細(xì)胞使其活化、增殖，引起強烈的免疫應(yīng)答。目前針對TSST-1本身的治療手段不多，合成寡核苷酸文庫和親和力篩選作為獲得高親和力、高特異性適配體(Aptamer)的一種方便、快捷、有效的方法

2、。本研究利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)篩選具有高親和力并特異性識別TSST-1的DNA適配體，并評估適配體對TSST-1功能的抑制作用，為探索金黃色葡萄球菌TSST-1誘導(dǎo)TSS新的治療方法奠定實驗基礎(chǔ)。
　　方法:我們選取TSST-1作為靶標(biāo)，體外合成中間含有25個隨機序列全長為63個堿基的單鏈DNA(

3、ssDNA)文庫。利用指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，以羧基磁珠作為固相介質(zhì)，從ssDNA文庫中篩選TSST-1適配體，利用生物信息學(xué)方法對適配體進(jìn)行序列同源性分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，通過凝膠阻滯實驗驗證適配體結(jié)合性質(zhì)，運用熒光定量法分析候選適配體的親和力及特異性，CCK-8法檢測候選適配體對TSST-1刺激PBMCs增殖抑制反應(yīng)。
　　結(jié)果:經(jīng)過8輪的反復(fù)篩選，監(jiān)測ssDNA文庫的親和力不斷升高，獲得了特異性識別TSST-1的DNA適配

4、體T-7，其全長為63nt。它可選擇性的與TSST-1結(jié)合，而與BSA，裸磁珠的交叉結(jié)合力較弱，并測定其與TSST-1的解離常數(shù)為103.8nM。當(dāng)適配體為10μM時，可有效抑制TSST-1介導(dǎo)的PBMCs增殖作用(P＜0.05)，其抑制率達(dá)63.6％。
　　結(jié)論:本研究利用bead-SELEX技術(shù)篩選出新型適配體T-7，它能選擇性識別TSST-1。在體外實驗中，該適配體能使TSST-1刺激PBMCs的增殖水平明顯降低(P＜0.0