與石房蛤毒素特異結(jié)合的適配體的優(yōu)化及其驗(yàn)證.pdf

1、石房蛤毒素(STX)是麻痹性貝類(lèi)毒素家族中的一員，由海洋藻類(lèi)合成后，通過(guò)食物鏈作用富集于甲殼類(lèi)和軟體動(dòng)物體內(nèi)，經(jīng)人類(lèi)和海洋動(dòng)物食用后產(chǎn)生麻痹性貝類(lèi)中毒。該毒素主要通過(guò)阻斷可興奮細(xì)胞表面的鈉離子通道產(chǎn)生毒性效應(yīng)。為了保證人類(lèi)的健康不受威脅，對(duì)STX進(jìn)行檢測(cè)尤為重要。然而，STX的檢測(cè)，尤其是快速檢測(cè)中，最關(guān)鍵的部分是STX的分子識(shí)別元件。核酸適配體是通過(guò)指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選出來(lái)的能夠與多種靶分子如藥物，蛋白質(zhì)，其他

2、無(wú)機(jī)或有機(jī)分子高親和力高特異性地結(jié)合的一小段寡核苷酸序列(DNA或RNA)。相對(duì)于抗體，它有著多種自身優(yōu)勢(shì)，包括其穩(wěn)定性，低免疫原性，易于自動(dòng)化學(xué)合成等，已作為分子識(shí)別元件應(yīng)用于靶分子檢測(cè)，疾病診斷，疾病治療等多方面。為了找到候選的STX分子識(shí)別元件，先前Handy等人已經(jīng)通過(guò)SELEX技術(shù)篩選出一條DNA適配體，APTSTX1。然而，它的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，關(guān)于功能的研究以及篩選后的優(yōu)化都沒(méi)有得到相關(guān)報(bào)道，這些對(duì)于改善其特性從而更好地應(yīng)用都是

3、必要的。
　　由于PCR的擴(kuò)增偏性和實(shí)驗(yàn)操作導(dǎo)致的文庫(kù)多樣性降低等原因，一些與靶分子高親和力結(jié)合的適配體無(wú)法通過(guò)SELEX技術(shù)篩選出來(lái)。多個(gè)團(tuán)隊(duì)成功地通過(guò)突變的方法對(duì)已經(jīng)篩選得到的適配體進(jìn)行優(yōu)化，并獲得比原始序列親和力更高卻未被篩選出來(lái)的序列。本研究中，采用類(lèi)似的方法，在理性分析的基礎(chǔ)上對(duì)APTSTX1進(jìn)行突變，期望得到潛在的具有更高親和力的適配體。G-四聯(lián)體是一種高度有序高穩(wěn)定性的核酸空間結(jié)構(gòu)，如果經(jīng)過(guò)突變適配體能夠形成G-四聯(lián)

4、體結(jié)構(gòu)，則可能會(huì)與靶分子結(jié)合地更緊密，表現(xiàn)出更高的親和力。因此，設(shè)計(jì)了多條突變序列（包括單點(diǎn)突變及多點(diǎn)突變），將鳥(niǎo)嘌呤核苷酸任一端或兩端的核苷酸也突變?yōu)轼B(niǎo)嘌呤核苷酸，因?yàn)轼B(niǎo)嘌呤核苷酸為G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)所必需。借助QGRS Mapper軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，將可能折疊成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的序列進(jìn)行合成并采用生物膜干涉的方法進(jìn)行親和力測(cè)定。其中部分序列與APTSTX1相比親和力得到提高，而親和力最高的是M-30，比APTSTX1提高了30倍。在此基礎(chǔ)

5、上，對(duì)M-30進(jìn)一步截短，分別將兩端的游離序列和四個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)逐個(gè)移除，并進(jìn)行親和力測(cè)定。通過(guò)對(duì)這些截短序列的結(jié)構(gòu)與親和力之間的關(guān)系進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合STX的核心序列是5'端的兩個(gè)莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。將其他多余的核苷酸移除后，得到M-30f，通過(guò)生物膜干涉的方法測(cè)得其Kd值為133nM，與M-30相比親和力并未明顯下降。最后，通過(guò)多種方法（ELISA，細(xì)胞生物學(xué)分析和小鼠生物檢測(cè)），對(duì)優(yōu)化前后的兩條適配體(APTSTX1及M-30f)進(jìn)行了親

6、和力比較，并對(duì)它們的STX抑制活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。兩條適配體與STX結(jié)合的能力在三種方法中都得到驗(yàn)證。ELISA和細(xì)胞生物學(xué)測(cè)定的結(jié)果表明，STX與APTSTX1、M-30f的相互作用間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，M-30f的結(jié)合能力更強(qiáng)，并且兩條適配體均可以拮抗STX的鈉離子通道抑制活性，而M-30f的抑制效果更好。
　　總之，優(yōu)化后的序列，M-30f，性能優(yōu)于其母序列。作為STX的分子識(shí)別元件，M-30f具有更好的實(shí)際應(yīng)用前景。此外，理