HIV-P24核酸適配體的篩選.pdf

1、核酸適配體是通過SELEX技術篩選得到的一類寡核苷酸分子，能與靶分子強特異、高親和力地結合，并發(fā)揮生物學效應。由于其具有靶分子范圍廣、分子質量小、免疫原性低、易于化學合成、改造和標記等優(yōu)點，核酸適配體在臨床診斷和疾病治療領域中顯現出重要的應用價值。P24蛋白是1型人類免疫缺陷病毒(HIV-1)的核心抗原，可作為HIV感染窗口期檢測的血清標志物，血液中P24的測定在臨床醫(yī)學中也是艾滋病病情監(jiān)控的一個重要指標。本課題利用SELEX技術篩選H

2、IV-P24特異性核酸適配體，為建立核酸適配體輔助的P24檢測方法奠定基礎，對艾滋病的診斷和治療具有重要意義。
　　 在本實驗中，我們以重組HIV-P24為特異靶標，利用消減SELEX的策略從隨機寡核苷酸庫中篩選能與P24結合的寡核苷酸，并通過凝膠阻滯實驗(EMSA)驗證篩選到的次級庫寡核苷酸與P24的結合。通過酶切、連接反應，將已獲得的與P24結合的次級庫寡核苷酸與載體pMD18-T構建成重組質粒，然后轉化大腸桿菌JM-109

3、形成單克隆以分離不同序列的寡核苷酸。利用不對稱PCR制備寡核苷酸ssDNA，通過斑點雜交實驗(Dot-blot)篩選與P24強結合的寡核苷酸，并檢測核酸適配體識別P24的特異性。
　　 經過12輪的SELEX篩選，獲得了針對HIV-P24富集的次級寡核苷酸庫。凝膠阻滯實驗顯示，篩選到的寡核苷酸與P24結合。Dot-blot篩選到7條與P24有較強結合能力的寡核苷酸。特異性檢測顯示，18和27號適配體只與P24特異性結合，與人血清