密度感知信號系統(tǒng)在MRSA感染及紅霉素干預(yù)作用的研究.pdf

1、目的:(1)測定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的生長曲線，檢測紅霉素對MRSA菌株的最低殺菌濃度，指導(dǎo)后期實(shí)驗(yàn)中對細(xì)菌接種時間及紅霉素應(yīng)用濃度的把握。(2)構(gòu)建MRSA生物膜模型。(3)探究紅霉素對MRSA生物膜的破壞作用以及紅霉素對密度感知信號(QS)系統(tǒng)相關(guān)因子的影響。
　　方法:(1)挑取單菌落于5ml TSB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)16h后，將細(xì)菌懸液按1∶1000接種于TSB培養(yǎng)基中，每2h取出200μl菌懸液于5

2、95nm處測量吸光度值，得到細(xì)菌生長曲線;挑取單菌落于5ml TSB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)16小時，調(diào)整濃度至108CFU/ml備用;在96孔板中倍比稀釋紅霉素，將備用的細(xì)菌懸液加入相應(yīng)孔中，37℃過夜培養(yǎng)，取此細(xì)菌懸液50μl垂直滴于固體培養(yǎng)基上均勻涂布，37℃靜置24小時，觀察菌落生長情況。(2)建立生物膜模型。以聚氯乙烯(PVC)材質(zhì)的96孔板作為細(xì)菌的粘附載體，以胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)為液體培養(yǎng)基，將對數(shù)后期細(xì)菌懸液濃度調(diào)

3、整至108CFU/ml后接種于載體上，37℃靜置培養(yǎng)，以結(jié)晶紫染色法觀察生物膜狀態(tài)。(3)細(xì)菌接種24h后給予紅霉素干預(yù)，取作用6h、12h、24h、48h、72h及7d時的細(xì)菌上清及大鼠血清，檢測QS系統(tǒng)中的信號傳導(dǎo)因子自分泌誘導(dǎo)肽(AIP)的變化趨勢。
　　結(jié)果:(1)細(xì)菌接種至液體培養(yǎng)基中后，2～4h為生長適應(yīng)期，從第4h起已開始進(jìn)入對數(shù)生長期，持續(xù)16h，隨后細(xì)菌開始進(jìn)入生長穩(wěn)定期;紅霉素對MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株的最低殺菌濃度為

4、256mg/L。(2) PVC96孔板經(jīng)結(jié)晶紫染色可見孔壁氣液交界處一層紫色連續(xù)性片狀生物膜。(3)細(xì)菌接種24h后給予紅霉素或TSB干預(yù)，短時間內(nèi)生物膜有減少趨勢，隨后又逐漸增加，最終穩(wěn)定存在，但實(shí)驗(yàn)組生物膜整體水平低于TSB組。(4)生物膜發(fā)展成熟后棄去細(xì)菌懸液，予紅霉素或TSB直接作用于生物膜，可見從48h開始，兩組出現(xiàn)不同的發(fā)展趨勢，實(shí)驗(yàn)組生物膜逐漸減少，最后基本完全消散;而TSB組生物膜初始減少后又增多，兩組具有顯著性差異。(

5、5)細(xì)菌接種后不同時間段給予紅霉素干預(yù)，只有3h之內(nèi)干預(yù)可有效殺菌，且無生物膜形成。(6) AIP的發(fā)展趨勢相似于并且早于生物膜的發(fā)展趨勢。(7)給予紅霉素干預(yù)后AIP的合成或分泌減少。
　　結(jié)論:(1)以PVC材料為粘附載體可成功構(gòu)建MRSA生物膜模型。(2)在細(xì)菌未形成生物膜時及時給予紅霉素干預(yù)，可以有效殺菌;紅霉素可以破壞已形成的生物膜。(3) AIP是促進(jìn)生物膜形成的重要因素。(4)紅霉素對AIP的合成或分泌有一定的抑制作