炙甘草湯調(diào)節(jié)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞參與造血的理論和實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究炙甘草湯對(duì)培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞造血因子分泌、細(xì)胞表面受體表達(dá)及給藥后相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)造血祖細(xì)胞增殖的影響，探討“補(bǔ)心方劑”炙甘草湯在造血相關(guān)過(guò)程的參與程度，為難治性血液疾病的治療提供新的思路。
　　方法：
　?。?）體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926），選取炙甘草湯及右歸飲兩個(gè)方劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置炙甘草湯組、右歸飲組、混合組（炙甘草湯+右歸飲）及空白對(duì)照組，在給藥后第3、6、9天分別收取

2、細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌情況。
　?。?）體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926），選取炙甘草湯與右歸飲兩個(gè)方劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置炙甘草湯組、右歸飲組、混合組（炙甘草湯+右歸飲）及空白對(duì)照組，在給藥后利用免疫組化方法檢測(cè)細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體表達(dá)情況。
　　（3）體外培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株（EA.hy926），選取炙甘草湯與右歸飲兩個(gè)方劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)置炙甘草湯組、右歸飲組、混合組（炙甘草湯

3、+右歸飲）及空白對(duì)照組，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液；分離人臍帶血單個(gè)核細(xì)胞，將收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液及相應(yīng)中醫(yī)湯劑分別加入培養(yǎng)體系中，觀察HPP-CFC、BFU-E集落形成情況。
　　結(jié)果：
　　1．炙甘草湯對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞造血因子分泌的影響：
　?。?）TGF-β1分泌：給藥組均明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β1，與空白對(duì)照組相比差異顯著（P<0.001）。實(shí)驗(yàn)初期（第3、6天）炙甘草湯刺激效果較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)后期（第9天）混合

4、給藥組表現(xiàn)出更好的刺激效果。
　?。?）G-CSF分泌：給藥組均明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生G-CSF，與空白對(duì)照組相比差異顯著（P<0.001）。混合給藥組刺激效果最明顯，其次為炙甘草湯組。給藥后細(xì)胞因子分泌均隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加。
　?。?) TPO分泌：第6天，炙甘草湯明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TPO，與空白對(duì)照相比差異顯著（p<0.001）；第9天，炙甘草湯單獨(dú)作用以及兩種中藥聯(lián)合使用時(shí)TPO的產(chǎn)生與對(duì)照相比也有明顯差異。

5、
　?。?) EPO分泌：第6天與第9天，右歸飲作用時(shí)能夠刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生EPO，但炙甘草湯單獨(dú)作用以及兩種中藥聯(lián)合使用時(shí)卻不能明顯刺激細(xì)胞產(chǎn)生EPO。
　?。?）IGF-1分泌：在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，給藥組與對(duì)照組 IGF-1分泌水平相同，沒(méi)有明顯差異。6）中藥給藥組及對(duì)照組均未檢測(cè)到GM-CSF、IL-3、SCF、VEGF的分泌。
　　2．炙甘草湯對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面細(xì)胞因子受體影響：
　?。?）EPO-R

6、表達(dá)：三個(gè)給藥組均能刺激 EPO-R表達(dá)上調(diào)，但僅以右歸飲組刺激效果最明顯（與空白對(duì)照組相比P<0.05）；
　?。?）FLT3表達(dá)：中藥刺激后給藥組均下調(diào)FLT3表達(dá)，其中以炙甘草湯組為最明顯（與空白對(duì)照組相比P<0.001）。
　?。?）GM-CSF受體表達(dá)：混合用藥時(shí)下調(diào)作用最明顯（與空白對(duì)照組相比P<0.01），其次是炙甘草湯組（與空白對(duì)照組相比P<0.05）；
　?。?）G-CSF受體表達(dá)：兩個(gè)中藥方劑均能明

7、顯引起受體下調(diào)表達(dá)，其中右歸飲下調(diào)效果最明顯（與空白對(duì)照組相比P<0.001）。
　　3.炙甘草湯細(xì)胞培養(yǎng)上清對(duì)造血祖細(xì)胞集落形成的影響：
　?。?）BFU-E形成：細(xì)胞培養(yǎng)上清液均能刺激細(xì)胞集落形成，其中尤以炙甘草湯組最為明顯，其次是混合組與右歸飲組。在細(xì)胞培養(yǎng)上清組中炙甘草湯培養(yǎng)上清組與混合給藥培養(yǎng)上清組兩組與空白細(xì)胞上清組相比差異明顯。
　?。?）HPP-CFC形成：?jiǎn)为?dú)添加中藥湯劑并不能明顯刺激HPP-CFC集

8、落形成，各培養(yǎng)上清組均能刺激集落形成增加，炙甘草湯細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激集落形成效果最明顯，與空白對(duì)照組相比P<0.001，其次是右歸飲培養(yǎng)上清與混合中藥培養(yǎng)上清，與空白對(duì)照組相比P<0.01。
　　結(jié)論：
　　1.炙甘草湯能促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞造血相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，合并右歸飲作用時(shí)效果更加明顯。
　　2.炙甘草湯能下調(diào)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面部分細(xì)胞因子受體的表達(dá)，從而增加游離細(xì)胞因子的含量。
　　3.炙甘草湯細(xì)胞培養(yǎng)上清