谷胱甘肽的合成及其活性的初步評(píng)價(jià).pdf

1、谷胱甘肽(Glutathione)是人體內(nèi)源活性肽之一，廣泛存在于動(dòng)、植物中，在生物體內(nèi)有著重要的作用?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)表明，其不僅具有較強(qiáng)的清除自由基作用，還可以用于肝、腎細(xì)胞膜的保護(hù)、有機(jī)物中毒、抑制肺間質(zhì)纖維化等多種生理功能?，F(xiàn)被廣泛應(yīng)用于肝腎保護(hù)、解毒、抗癌等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[1]。由于其分子小，容易被肌體吸收，不易被消化酶破壞，可作為食品添加劑，提高營(yíng)養(yǎng)，加強(qiáng)食品風(fēng)味及防止變質(zhì)[2]，同時(shí)可制成復(fù)合制劑和保健藥品用于人體保健[3-5]，此

2、外將其添加到化妝品中，美白效果明顯優(yōu)于普通化妝品。
　　近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外對(duì)谷胱甘肽的作用機(jī)制等已經(jīng)做了大量的理論和實(shí)踐研究。目前的研究主要集中在藥理作用和新用途開(kāi)發(fā)上，隨著其應(yīng)用范圍越來(lái)越廣，需求量日益增加，而目前的生產(chǎn)工藝方法如發(fā)酵法等因胞內(nèi)產(chǎn)物含量低，細(xì)胞密度低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等問(wèn)題，生產(chǎn)規(guī)模有限，不能很好的適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求。
　　還原型谷胱甘肽（GSH）由谷、胱、甘種氨基酸組成，谷氨酸分別以α和γ羧基形成酰胺鍵，得到α-

3、GSH與γ-GSH。其中α-GSH是非天然產(chǎn)物肽，其保留了活性位點(diǎn)-游離巰基（-SH），本研究中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，其肝損傷治療作用顯著。目前合成方法以液相合成法為主，但因操作復(fù)雜、生產(chǎn)周期長(zhǎng)，不易純化等，應(yīng)用受到限制。而氧化型谷胱甘肽（GSSG）是γ-GSH很好的協(xié)同抗氧化藥物，目前合成以雙氧水法為主，但其存在成本高、生產(chǎn)周期較長(zhǎng)等問(wèn)題。故探索國(guó)產(chǎn)谷胱甘肽的合成新工藝，并對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以降低成本，成為越來(lái)重要的課題。
　　本

4、研究先采用Fmoc固相合成法，以2-Cl-CTC樹(shù)脂為載體，DIC/HOBt為縮合劑，逐步縮合得到肽樹(shù)脂，經(jīng)不同的裂解劑裂解得粗肽，經(jīng)半制備純化后凍干，得α-GSH、γ-GSH純品。γ-GSH分別經(jīng)空氣、碘、雙氧水氧化后得GSSG。半制備純化后得純品，ESI-MS進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析鑒定，并比較三種合成藥物（α-GSH、γ-GSH、GSSG），與陽(yáng)性對(duì)照藥（γ-GSH，發(fā)酵法所得）對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的療效差異，通過(guò)肝細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化進(jìn)

5、行療效確證。為大規(guī)模生產(chǎn)實(shí)現(xiàn)提供基礎(chǔ)和理論支持。
　　第一部分谷胱甘肽的化學(xué)合成
　　目的：
　　先采用Fmoc固相合成方法合成α-GSH、γ-GSH，再利用不同的氧化方法將γ-GSH氧化為 GSSG，探索合成、切割、氧化、純化等條件，并確立所得產(chǎn)物的檢測(cè)方法，最終得到純度較高的目標(biāo)產(chǎn)品。
　　方法：
　　1、還原型谷胱甘肽的固相合成（α-GSH、γ-GSH）
　　以Fmoc固相合成方法分別合成α-G

6、SH、γ-GSH。選擇適合、廉價(jià)的樹(shù)脂為載體，使用高效、副反應(yīng)少、廉價(jià)的縮合體系，探索樹(shù)脂替代度、投料摩爾比、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度對(duì)合成結(jié)果的影響，以盡可能減少接肽過(guò)程中的副反應(yīng)，最終獲得較好的純度和收率；接肽過(guò)程中利用 Kaiser反應(yīng)以檢測(cè)氨基酸的連接程度。
　　2、肽樹(shù)脂的切割、純化
　　根據(jù)氨基酸保護(hù)基團(tuán)的不同，選擇不同的切割試劑配方，平行試驗(yàn)，以粗肽的純度和收率為指標(biāo)，優(yōu)化切割條件；切割后的多肽經(jīng)冰乙醚沉淀后得粗肽，

7、真空干燥至恒重；反相半制備型 HPLC分離純化，冷凍干燥后獲得最終產(chǎn)品。
　　3、 GSSG的制備及純化
　　以γ-GSH純品為原料，分別采用空氣、雙氧水、碘氧化法將其氧化為GSSG；HPLC監(jiān)測(cè)，以峰面積百分比為指標(biāo)，優(yōu)化各種方法的反應(yīng)條件；在各自的優(yōu)化條件下，以產(chǎn)物純度和收率為指標(biāo)，以獲得較優(yōu)的氧化方法。
　　4、三種谷胱甘肽的結(jié)構(gòu)分析鑒定
　　利用標(biāo)準(zhǔn)品HPLC，對(duì)合成的α-GSH、γ-GSH、GSSG進(jìn)行

8、定位，并進(jìn)行HPLC純度分析；ESI-MS分析確證各自的分子量。
　　結(jié)果：
　　1、α-GSH、γ-GSH為短肽，沒(méi)有復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)，故選擇適合短肽合成且較廉價(jià)的2-Cl-CTC樹(shù)脂為載體；縮合體系選擇產(chǎn)生高效、副反應(yīng)少的DIC/HOBt；反應(yīng)投料比在1:3時(shí)能充分反應(yīng)；反應(yīng)時(shí)間2.5 h即可，但由于Cys易消旋，宜縮短反應(yīng)時(shí)間在2 h左右；反應(yīng)溫度以室溫（25℃~35℃）較好；替代度在0.9~0.95 mmol/g時(shí)較好

9、，優(yōu)選0.94 mmol/g。
　　2、γ-GSH的四種切割試劑脫除保護(hù)基的效果相似，但有差異，綜合考慮所得粗肽純度、收率及成本，以切割配方TFA：EDT：間甲酚（95:4:1）較優(yōu)。α-GSH肽樹(shù)脂的裂解效果與之類似。切割實(shí)驗(yàn)時(shí)，反應(yīng)液宜在冰浴之中冷凍0.5 h，再逐步升至室溫（30℃）繼續(xù)反映1 h得到的產(chǎn)物副反應(yīng)少，純度好，產(chǎn)品穩(wěn)定且收率較高。
　　3、通過(guò)HPLC圖譜峰面積百分比比較，獲得了各自較優(yōu)的氧化條件：空氣（

10、室溫、底物濃度20 mg/mL、pH6，反應(yīng)72 h）；碘（室溫、底物濃度150 mg/L、碘與底物摩爾比1:1.5，pH3，反應(yīng)0.5 h）；雙氧水（室溫、底物濃度200 mg/mL、30％雙氧水用量5%，pH6，反應(yīng)時(shí)間2 h）；在各自優(yōu)化條件下，各氧化法所得GSSG純度分別為90%、98%、95%，收率分別為70%、90%、91%。
　　4、合成的α-GSH、γ-GSH、GSSG經(jīng) HPLC經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品定位，ESI-MS確證分子

11、量，合成正確；所獲得的α-GSH、γ-GSH純品的純度大于99%，GSSG純度大于98%。
　　結(jié)論：
　　本課題先采用Fmoc固相合成法合成得到了α-GSH、γ-GSH純品，并在氧化劑作用下將γ-GSH純品氧化成GSSG；在合成過(guò)程中優(yōu)化了合成、裂解、氧化、純化等條件；所得產(chǎn)物經(jīng)HPLC定位，ESI-MS確證分子量，均與理論值相符。
　　第二部分合成谷胱甘肽對(duì)小鼠急性肝損傷療效初步評(píng)價(jià)
　　目的：
　　通

12、過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察三種合成谷胱甘肽（α-GSH、γ-GSH、GSSG，實(shí)驗(yàn)室合成）與陽(yáng)性對(duì)照藥（注射用γ-GSH，市售）對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的治療效果，以初步評(píng)價(jià)其活性。
　　方法：
　　1、采用經(jīng)典的CCl4誘導(dǎo)昆明系成年雄性小鼠急性肝損傷方法造模；造模成功后，每24 h按80 mg/kg、40 mg/kg、20 mg/kg劑量給予小鼠合成藥物，并設(shè)立對(duì)照組，連續(xù)腹腔注射給藥7 d，觀察各組小鼠血清中AL

13、T、AST活性水平的變化，并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　2、給藥7 d后處死動(dòng)物，采取各組小鼠新鮮肝臟組織，HE染色后，觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異，以確定合成谷胱甘肽對(duì)小鼠急性肝損傷的療效。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)各組間兩樣本t檢驗(yàn)知，三種合成化學(xué)物高劑量（80 mg/kg）、中劑量（40 mg/kg）可以顯著降低小鼠血清中ALT、AST水平(P<0.01)，且其治療效果與同等劑量的注射用γ-GSH

14、無(wú)顯著性差異(P>0.05)，而低劑量（20 mg/kg）可以一定程度的降低小鼠肝臟ALT、AST水平(P<0.05)。
　　2、小鼠肝臟組織經(jīng)HE染色后，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組，三組高、中劑量給藥組小鼠肝細(xì)胞排列規(guī)則，形態(tài)結(jié)構(gòu)較正常，核質(zhì)分布均勻，中央靜脈及匯管區(qū)清晰可見(jiàn)，CC14模型組小鼠肝組織損傷嚴(yán)重，肝細(xì)胞排列紊亂，多數(shù)肝細(xì)胞水腫，有明顯的壞死現(xiàn)象，壞死區(qū)肝細(xì)胞發(fā)生不同程度的氣球樣變，肝竇以及肝中央靜脈擴(kuò)張。