利用小RNA介導(dǎo)的基因沉默實(shí)現(xiàn)R基因在不同科植物中的應(yīng)用.pdf

1、植物內(nèi)源sRNA(小RNA)在調(diào)控基因表達(dá)過(guò)程中起重要作用，它們可以通過(guò)激活或抑制特定基因的表達(dá)，從而影響植物的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。其中，sRNA在植物病原菌互作中的調(diào)控機(jī)制引起人們極大的關(guān)注。
　　在植物與病原長(zhǎng)期互作過(guò)程中，植物進(jìn)化出兩個(gè)基礎(chǔ)免疫系統(tǒng):病原相關(guān)分子模式（PAMP）激發(fā)的免疫反應(yīng)(PTI)和效應(yīng)蛋白（effector protein）激發(fā)的免疫反應(yīng)(ETI)。病原的effector具有進(jìn)化快、多樣性強(qiáng)的特點(diǎn)，植物在進(jìn)

2、化過(guò)程中積累了大量R基因以應(yīng)對(duì)不同病原微生物的挑戰(zhàn)。由于植物內(nèi)源的R(Resistence)基因受到嚴(yán)格的控制，所以在轉(zhuǎn)基因植物中過(guò)量表達(dá)R基因往往會(huì)導(dǎo)致植株發(fā)育異常。小分子RNA是植物整個(gè)生命過(guò)程中重要的調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平上通過(guò)與靶基因序列互補(bǔ)配對(duì)的方式調(diào)控基因表達(dá)，在病原微生物入侵植物過(guò)程中有重要的基因表達(dá)調(diào)控作用。因此我們想通過(guò)構(gòu)建以R基因?yàn)榘谢虻娜斯iRNA來(lái)降低R基因的表達(dá)量，當(dāng)病原入侵植物時(shí)，病原微生物一

3、方面會(huì)全面降低sRNA的表達(dá)水平，另一方面，病原體會(huì)利用植物的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體來(lái)促進(jìn)自身對(duì)植株的侵染，破壞植物體內(nèi)的sRNA調(diào)控機(jī)制，此時(shí)R基因轉(zhuǎn)錄出的mRNA得以翻譯，R基因高豐度表達(dá)，以此達(dá)到抗病的目的。
　　本研究以擬南芥和煙草作為研究材料，以抗煙草花葉病毒的N基因以及抗丁香假單胞桿菌的RPS4基因?yàn)檠芯繉?duì)象，試圖利用小分子RNA介導(dǎo)的基因沉默，來(lái)實(shí)現(xiàn)兩個(gè)物種之間抗病基因的利用。主要研究結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建好a

4、miR6019的表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)入哥倫比亞型擬南芥中，獲得不同程度表達(dá)amiR6019的轉(zhuǎn)基因擬南芥;在此基礎(chǔ)上，成功轉(zhuǎn)入煙草N基因，獲得生長(zhǎng)正常的轉(zhuǎn)基因擬南芥。此結(jié)果提供一種抗病研究的新方法:利用R silencer促進(jìn)物種間R基因的資源利用。
　　2.設(shè)計(jì)并構(gòu)建好四個(gè)靶定RPS4的artificial microRNA表達(dá)載體，并獲得四種轉(zhuǎn)基因煙草;構(gòu)建了RPS4、RRS1、avrRPS4的表達(dá)載體并做瞬時(shí)表達(dá)驗(yàn)證;摸索了丁