Caveolin-1-NF-κB-HMGB1通路在內(nèi)皮損傷中的作用和高脂血癥中普羅布考保護(hù)EPC的機(jī)制.pdf

1、本研究分為以下兩個(gè)部分:
　　第一部分 Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信號(hào)通路在ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及巨噬細(xì)胞遷移中的作用
　　目的:
　　觀察Caveolin-1、NF-κB和HMGB1在ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用而進(jìn)一步明確ox-LDL損傷內(nèi)皮的機(jī)制，并探討該通路尤其是HMGB1在損傷內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移中的作用
　　方法:
　　1.在ox-LDL誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞

2、損傷的實(shí)驗(yàn)中，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株CRL-1730細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在細(xì)胞生長(zhǎng)至80％單層細(xì)胞融合時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分組并以不同濃度的ox-LDL處理內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)構(gòu)建內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型。實(shí)驗(yàn)組的ox-LDL濃度梯度分別為10、20、40μg/ml，而以同等體積的PBS處理內(nèi)皮細(xì)胞作為對(duì)照組。加入ox-LDL或者PBS后的內(nèi)皮細(xì)胞孵育24h后，按照相應(yīng)的要求分別提取細(xì)胞漿蛋白、線(xiàn)粒體蛋白、細(xì)胞核蛋白和細(xì)胞總蛋白，并通過(guò)Western Blo

3、t檢測(cè)蛋白提取物中caveolin-1和NF-κB p65的表達(dá)和磷酸化水平與細(xì)胞色素C(cytochrome C，CytC)C和HMGB1在細(xì)胞內(nèi)的分布。
　　2.在siRNAs轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，將HUVECs接種于6孔板內(nèi)（2×105個(gè)/孔），每孔中加入2ml含10％胎牛血清、不含雙抗的培養(yǎng)基，培養(yǎng)至約50％單層細(xì)胞融合時(shí)洗滌細(xì)胞，然后分別加入按照要求配制好的si-Cav1、si-p65或si-HMGB1，孵育12h后向各試驗(yàn)組中加

4、入ox-LDL（終濃度為40μg/ml）處理內(nèi)皮細(xì)胞。再孵育24h后，離心后收集細(xì)胞，按照相應(yīng)的要求提取細(xì)胞總蛋白和細(xì)胞漿蛋白，并通過(guò)Western Blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白中caveolin-1和NF-κB p65的表達(dá)和磷酸化水平、細(xì)胞漿蛋白中CytC的表達(dá)水平、細(xì)胞總蛋白中Pro-caspase-3和剪切活化后的caspase-3的表達(dá)水平與細(xì)胞總蛋白和胞漿蛋白中HMGB1的表達(dá)水平。我們還收集了各組細(xì)胞的培養(yǎng)基，經(jīng)離心后獲得細(xì)胞培

5、養(yǎng)基上清液，并以Western Blot檢測(cè)了由內(nèi)皮細(xì)胞釋放到胞外的HMGB1的相對(duì)水平。
　　3.在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，用si-Cav1、si-p65和si-HMGB1以上面介紹過(guò)的步驟分別轉(zhuǎn)染HUVECs沉默相應(yīng)蛋白后再以ox-LDL（終濃度為40μg/ml）處理轉(zhuǎn)染后的各組HUVECs24h。向另一組HUVECs加入同等體積的PBS作為對(duì)照組。以Annexin V和PI雙標(biāo)染色，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡水平。

6、　　4.在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，我們將dil標(biāo)記的ox-LDL以40μg/ml終濃度加入分別轉(zhuǎn)染si-Cavl、si-p65或si-HMGB1后的各組HUVECs培養(yǎng)基中，避光孵育6h后吸去培養(yǎng)基，PBS漂洗，以4％多聚甲醛室溫下固定細(xì)胞，用3％的Triton-X100室溫下破膜。以羊血清室溫下封閉后，加入1∶500兔抗人HMGB1單抗在4℃下孵育過(guò)夜，然后加入1∶20的FITC標(biāo)記的羊抗兔的熒光二抗在37℃下孵育45min，以PBS漂洗

7、后應(yīng)用抗熒光淬滅封片液封片，在暗室中分別以490/525nm、550nm/565nm為激發(fā)光/濾光頻率在熒光顯微鏡下觀察。每張玻片同取200倍數(shù)放大，取5個(gè)不同視野，觀察HUVECs內(nèi)ox-LDL的含量和HMGB1的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.Ox-LDL以濃度依賴(lài)的方式上調(diào)caveolin-1的表達(dá)和磷酸化水平，促進(jìn)NF-κBp65的磷酸化和CytC由線(xiàn)粒體向細(xì)胞漿的釋放，并上調(diào)HMGB1在細(xì)胞漿內(nèi)表達(dá)水平而下調(diào)HMGB1

8、的胞核內(nèi)表達(dá)水平。
　　2.Ox-LDL引起HUVECs內(nèi)caveolin-1/NF-κB/HMGB1信號(hào)通路的顯著激活:ox-LDL誘導(dǎo)caveolin-1的表達(dá)及磷酸化水平上調(diào)，然后磷酸化激活NF-κB，繼而上調(diào)HMGB1的表達(dá)及其由胞核向胞漿內(nèi)的遷移;caveolin-1表達(dá)和磷酸化的上調(diào)激活的NF-κB反過(guò)來(lái)進(jìn)一步上調(diào)caveolin-1的表達(dá)和磷酸化。
　　3.Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信號(hào)通路在

9、ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs損傷和凋亡中發(fā)揮著重要作用:敲除caveolin-1可以顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)的線(xiàn)粒體損傷和HUVECs的凋亡;敲除NF-κB p65可以顯著阻斷ox-LDL誘導(dǎo)的線(xiàn)粒體損傷、caspase-3的活化和HUVECs的凋亡;在ox-LDL處理之前，抑制HMGB1的表達(dá)顯著引起HUVECs中線(xiàn)粒體的損傷;但是，在ox-LDL刺激后，敲除HMGB1顯著上調(diào)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs內(nèi)的線(xiàn)粒體

10、損傷、caspase-3剪切活化和HUVECs的凋亡。
　　4.Caveolin-1、NF-κB、HMGB1在內(nèi)皮細(xì)胞攝取ox-LDL的過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用:ox-LDL可以誘導(dǎo)HUVECs攝取ox-LDL和HUVECs內(nèi)HMGB1的表達(dá);caveolin-1和NF-κB p65的沉默可顯著抑制HUVECs對(duì)ox-LDL的攝取和ox-LDL誘導(dǎo)的HMGB1在HUVECs內(nèi)的表達(dá);而沉默HMGB1顯著促進(jìn)了HUVECs對(duì)ox-

11、LDL的攝取。
　　結(jié)論:
　　Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞攝取ox-LDL及ox-LDL誘導(dǎo)HUVECs損傷過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Caveolin-1/NF-κB/HMGB1信號(hào)通路參與了損傷內(nèi)皮誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移的過(guò)程，但損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放的HMGB1并未直接在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞遷移中發(fā)揮主要作用。
　　第二部分 Ox-LDL損傷在體內(nèi)皮祖細(xì)胞及普羅布考在高脂血癥中保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞的機(jī)制

12、>　　目的:
　　探討體內(nèi)環(huán)境下ox-LDL損傷內(nèi)皮祖細(xì)胞的機(jī)制及普羅布考在高脂血癥中保護(hù)內(nèi)皮祖細(xì)胞的可能機(jī)制。
　　方法:
　　1.動(dòng)物研究部分
　　1.1 制備ox-LDL
　　抽取健康志愿者的10ml外周靜脈血，置于肝素化的離心管中，以1500g離心20min收集血漿。以KBr將血漿密度調(diào)整至1.30g/ml，并鋪設(shè)生理鹽水層，以10℃、35000g離心60min，收集LDL。將LDL置于PBS中過(guò)夜

13、透析。過(guò)濾后以Lowry法進(jìn)行脂蛋白濃度定量后，以CuSO4氧化LDL-c，加入DETA溶液終止反應(yīng)，即可獲得ox-LDL溶液。
　　1.2 制備高脂血癥模型
　　將24只4-6周大的野生型雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分入三組:對(duì)照組、ox-LDL組和普羅布考組。Ox-LDL組和普羅布考組小鼠均每日接受一次尾靜脈注射50μg ox-LDL，連續(xù)3日，而對(duì)照組小鼠相應(yīng)地接受同等體積的PBS注射。普羅布考組小鼠在接受ox-LDL處

14、理前一天開(kāi)始接受500mg/kg/d普羅布考灌胃，連續(xù)3日。灌胃前，首先將普羅布考溶于99％的乙醇溶液中，并進(jìn)而以PBS稀釋。
　　1.3 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的ROS水平
　　小鼠經(jīng)過(guò)尾靜脈連續(xù)注射ox-LDL或者PBS3日后，取血和骨髓，并收集到肝素化的試管內(nèi)。用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，分別以流式細(xì)胞術(shù)或電子順磁共振法檢測(cè)外周血細(xì)胞內(nèi)ROS生成與骨髓細(xì)胞外ROS生成水平。
　　2.臨床研究部分
　　簽署知情同意

15、書(shū)的10名合并高血脂的冠心病患者和5位年齡和性別匹配的健康志愿者納入了研究?；颊吒鶕?jù)性別和年齡分層后隨即分入普羅布考處理組和安慰劑組。
　　2.1 收集基線(xiàn)數(shù)據(jù)
　　基線(xiàn)時(shí)，受試者空腹12h后抽取外周靜脈血，通過(guò)電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)患者的血脂、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，以ELISA法檢測(cè)患者血漿ox-LDL水平;在去除紅細(xì)胞

16、后以標(biāo)志物組合CD34+/KDR+來(lái)標(biāo)記人外周血中的EPC，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人外周血中EPC水平。
　　2.2 藥物治療
　　普羅布考組和安慰劑組分別接受普羅布考500mg或安慰劑每日兩次口服治療，連續(xù)7日。過(guò)程中，采用雙盲的方式減少偏倚。
　　3.數(shù)據(jù)分析
　　數(shù)據(jù)以均值士標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，以非配對(duì)t檢驗(yàn)來(lái)比較2組數(shù)據(jù)，以雙變量方差分析來(lái)比較3組間是否存在顯著性差異。以Shapiro-Wilk W-test來(lái)檢驗(yàn)數(shù)

17、據(jù)是否為正態(tài)分布，以F-檢驗(yàn)來(lái)檢驗(yàn)方差齊。如果數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布或者方差不齊時(shí)使用非參數(shù)Mann-Whitney U-test來(lái)比較數(shù)據(jù)。以P＜0.05（雙側(cè)）為差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.普羅布考阻斷ox-LDL誘導(dǎo)的骨髓單個(gè)核細(xì)胞的減少和外周血中的EPCs水平。
　　2.普羅布考削弱了ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)外的ROS的生成。
　　3.普羅布考降低了高脂血癥患者血清中的ox-LDL水平，而上調(diào)外周

18、血中的EPCs水平。
　　4.普羅布考增加高脂血癥患者外周血血漿中的SOD水平而降低CRP水平。
　　結(jié)論:
　　在體內(nèi)，ox-LDL誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與了內(nèi)皮祖細(xì)胞的損傷。通過(guò)抑制骨髓、外周血中細(xì)胞外ROS的生成和外周血中細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，普羅布考能夠有效地阻斷ox-LDL對(duì)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞及骨髓單個(gè)核細(xì)胞損傷。臨床試驗(yàn)中，普羅布考部分地逆轉(zhuǎn)了高脂血癥患者外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的減少。這種保護(hù)作用可能與普羅布考降低高脂血