“抗栓一號(hào)”基于Sirt1-TLR4-NF-κB炎癥通路對(duì)內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　以維生素（VitaminD3 VD3）腹腔注射結(jié)合高脂飲食誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷大鼠模型為研究對(duì)象，觀察“抗栓一號(hào)”（紅花、水蛭、蘇木）中藥復(fù)方對(duì)高脂誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷的保護(hù)作用。觀察“抗栓一號(hào)”中藥復(fù)方在改善大鼠動(dòng)物模型血脂水平的功效;觀察“抗栓一號(hào)”中藥復(fù)方對(duì)多種炎癥因子的調(diào)控能力;并對(duì)“抗栓一號(hào)”發(fā)揮抗炎作用改善內(nèi)皮損傷的作用機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　方法:
　　(1)利用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)“抗栓一號(hào)”復(fù)方

2、進(jìn)行有效成分的分析;
　　(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):參照腹腔注射VD3聯(lián)合高脂飼料的造模方法進(jìn)行內(nèi)皮損傷的造模。所有的大鼠首先用普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，1周后除空白組外開(kāi)始以上述的造模方法進(jìn)行造模。第一次腹腔注射給予VD360萬(wàn)U·kg-1，然后在第3、6、9周時(shí)各補(bǔ)充VD310萬(wàn)U·kg-1，使用預(yù)先配制好的高脂飼料進(jìn)行造模喂養(yǎng)，持續(xù)9周。將60只SD模型大鼠，隨機(jī)分為:中藥高劑量組、中劑量組、低劑量組，陽(yáng)性藥物組（瑞舒伐他汀），聯(lián)合用藥

3、組（陽(yáng)性藥組+中藥中劑量），模型組，另有10只SD大鼠為空白對(duì)照組，計(jì)7組。觀察主動(dòng)脈內(nèi)皮HE染色結(jié)果，檢測(cè)生化指標(biāo)血清總膽固醇(T-CHO)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、ELISA法測(cè)白介素1β(IL-1β)，白介素6(IL-6)，白介素12(IL-12)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)，免疫組化法檢測(cè)白介素1β(IL-1β)，白介素6（IL-6），白介素12(IL-12)，腫瘤

4、壞死因子α（TNF-α）等炎癥因子的表達(dá)水平;利用Western Blot和realtime-PCR方法對(duì)“抗栓一號(hào)”抗炎作用機(jī)制的研究，證實(shí)Sirt1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的可行性。
　　(3)細(xì)胞實(shí)驗(yàn):參照相關(guān)文獻(xiàn)，使用HUVEC細(xì)胞，利用ox-LDL進(jìn)行誘導(dǎo)構(gòu)造HUVEC損傷模型。取傳至5-7代的HUVEC細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)后給予不同濃度ox-LDL(10ug/ml～160ug/ml)，通過(guò)CCK8檢測(cè)法觀察ox-LDL對(duì)

5、HUVEC增殖的抑制情況，確定ox-LDL的誘導(dǎo)的濃度;對(duì)5～7代的HUVEC先進(jìn)行饑餓培養(yǎng)，再給予不同濃度的“抗栓一號(hào)”含藥血清（終濃度5％、10％、20％、40％），同樣利用CCK8法來(lái)觀察“抗栓一號(hào)”含藥血清對(duì)HUVEC的增殖影響與細(xì)胞毒性，來(lái)確定“抗栓一號(hào)”含藥血清的干預(yù)濃度。將細(xì)胞分為空白組、對(duì)照組、含藥血清低濃度組、含藥血清中濃度組、以及含藥血清高濃度組進(jìn)行培養(yǎng);在細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)中，提取細(xì)胞上清來(lái)檢測(cè)白介素1β（IL-1

6、β），白介素6(IL-6)，白介素12(IL-12)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)的指標(biāo);提取各組細(xì)胞的蛋白，利用Western Blot實(shí)驗(yàn)方法對(duì)Sirt1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證;以含藥血清（終濃度10％）為干預(yù)濃度，同時(shí)給予Sirt1蛋白抑制劑和TLR4蛋白抑制劑，利用Western Blot實(shí)驗(yàn)方法觀察當(dāng)上游基因Sirt1受到抑制與中游的TLR4蛋白收到抑制時(shí)，Sirt1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路中各蛋白

7、的表達(dá)情況，明確信號(hào)通路的正確性。
　　結(jié)果:
　　(1)高效液相分析:按照高效液相色譜法的實(shí)驗(yàn)步驟，從標(biāo)準(zhǔn)品中分離發(fā)現(xiàn)了:1.尿嘧啶核苷;2.次黃嘌呤核苷;3.鳥(niǎo)嘌呤核苷;4.紅花黃色素A;5.巴西蘇木素。
　　(2)動(dòng)物實(shí)驗(yàn):
　　①SD大鼠經(jīng)9周造模后，出現(xiàn)高脂誘導(dǎo)的內(nèi)皮損傷表現(xiàn)，通過(guò)對(duì)大鼠的胸主動(dòng)脈進(jìn)行HE染色。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的胸主動(dòng)脈出現(xiàn)了血管內(nèi)膜的不光滑，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞排列紊亂，而且連續(xù)性較差

8、，內(nèi)皮細(xì)胞間及皮膜下出現(xiàn)了泡沫細(xì)胞的大量蓄積，同時(shí)血管平滑肌細(xì)胞也變現(xiàn)有增生的改變;此外，通過(guò)記錄觀察到模型組大鼠的體重與空白組相比有明顯地降低;
　?、贖E染色結(jié)果:成模大鼠經(jīng)過(guò)藥物灌胃治療后，HE染色結(jié)果顯示，中藥各劑量組、陽(yáng)性藥物組以及聯(lián)合用藥組的血管內(nèi)膜與模型組相比，內(nèi)膜的染色結(jié)果有較大改善，相對(duì)排列規(guī)整，內(nèi)膜相對(duì)光滑，僅產(chǎn)生少量泡沫細(xì)胞的蓄積和平滑肌增生;
　?、垩?與空白組相比，模型組血脂水平TC、TG、L

9、DL均提高，HDL降低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，各干預(yù)組與模型組相比，除低劑量組外，高、中劑量組、陽(yáng)性藥組、聯(lián)合用藥組與模型組相比，TC均有顯著下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，低劑量組與模型組相比，TC下降趨勢(shì)較低，但仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);TG下降程度與TC各組相當(dāng)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，p＜0.05)，各干預(yù)組與模型組相比，LDL-c均下降且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，p＜0.05)，中藥各干預(yù)組

10、與模型組相比，高劑量組與中劑量組對(duì)HDL-c的改善與模型相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01與p＜0.05)，低劑量組與模型組相比無(wú)明顯差異(p＞0.05);
　?、苎装Y因子水平:免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:與空白組相比，模型組IL-1β，IL-6，IL-12，TNF-α水平均提高，而各干預(yù)組與模型組相比，炎癥因子的表達(dá)均下降;ELISA實(shí)驗(yàn)方法對(duì)血清中的炎癥因子水平進(jìn)行了測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與空白組，模型組IL-1β，IL-6，IL-12，T

11、NF-α水平均提高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，而各干預(yù)組與模型組相比，炎癥因子均下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);
　　⑤Sirt1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)結(jié)果:通過(guò)WB和RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明模型組的Sirt1蛋白水平與空白組相比顯著降低(p＜0.01)，TLR4和NF-κB顯著上調(diào)(p＜0.01)，在經(jīng)過(guò)各中藥干預(yù)組干預(yù)后結(jié)果顯示，中藥干預(yù)后Sirt1蛋白的表達(dá)水平升高，TLR4和NF-κB下

12、降(p＜0.01或p＜0.05)，且調(diào)整水平與中藥干預(yù)劑量呈相關(guān)性。PCR結(jié)果提示，模型組大鼠的Sirt1表達(dá)與空白組相比也有明顯降低(p＜0.01)，TLR4和NF-κB表達(dá)明顯升高(p＜0.01)，中藥干預(yù)后的結(jié)果與WB結(jié)果一致。
　　細(xì)胞實(shí)驗(yàn):
　?、賝x-LDL與“抗栓一號(hào)”含藥血清干預(yù)濃度:
　　1.在相在相同的藥物處理時(shí)間下，隨著ox-LDL濃度的增加，HUVEC細(xì)胞的相對(duì)活力逐漸減少，ox-LDL對(duì)原代H

13、UVEC細(xì)胞增殖的抑制率越大，而且抑制效果呈劑量依賴性。干預(yù)24小時(shí)后，發(fā)現(xiàn)80μg/mL濃度的ox-LDL對(duì)HUVEC細(xì)胞產(chǎn)生抑制增殖的作用，HUVEC細(xì)胞的相對(duì)活力明顯降低(p＜0.05)。最終使用80μg/mL濃度的ox-LDL干預(yù)HUVEC細(xì)胞，來(lái)進(jìn)行相關(guān)作用與機(jī)制的研究。
　　2.相同的藥物處理時(shí)間下，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著含藥血清濃度的增加，HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)情況更好，而且呈劑量依賴性。而HUVEC細(xì)胞在經(jīng)過(guò)40％濃度的

14、含藥血清處理后的存活率與20％的濃度出現(xiàn)差異(p＜0.05)。最終選用含藥血清濃度終濃度5％、10％、20％的三個(gè)給藥劑量，以此三種濃度的含藥血清進(jìn)行干預(yù)，來(lái)研究對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞損傷的作用與作用機(jī)制。
　?、谘装Y因子水平:ELISA實(shí)驗(yàn)方法對(duì)細(xì)胞上清中的炎癥因子水平進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示與空白組相比，ox-LDL干預(yù)組IL-1β，IL-6，IL-12，TNF-α水平均提高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，而含

15、藥血清干預(yù)組與ox-LDL干預(yù)組相比，炎癥因子均下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，且與濃度呈相關(guān)性;
　?、跾irt1/TLR4/NF-κB信號(hào)通路實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　與空白對(duì)照組相比，ox-LDL干預(yù)組的Sirt1蛋白水平明顯下調(diào)，TLR4、NF-κB蛋白水平明顯上調(diào)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);經(jīng)過(guò)“抗栓一號(hào)”含藥血清干預(yù)后，Sirt1蛋白水平出現(xiàn)明顯升高，相應(yīng)的，TLR4、NF-κB蛋白水平明顯下調(diào)，且蛋白的調(diào)整水

16、平與含藥血清干預(yù)的濃度有相關(guān)性，其中10％與20％濃度的含藥血清對(duì)蛋白的調(diào)整與模型組相比，下調(diào)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，5％濃度的含藥血清對(duì)蛋白的調(diào)整與模型組相比，調(diào)整趨勢(shì)較低(p＜0.05);
　　加入Sirt1蛋白抑制劑后，“抗栓一號(hào)”含藥血清干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC引起的Sirt1上調(diào)程度與未加蛋白抑制劑相比，Sirt1上調(diào)程度有明顯差異(p＜0.01);同時(shí)TLR4與NF-κB的蛋白表達(dá)兩組間也有明顯差異(p

17、＜0.01，p＜0.05);
　　加入TLR4蛋白抑制劑后，“抗栓一號(hào)”含藥血清干預(yù)ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC引起的TLR4下調(diào)調(diào)程度與未加蛋白抑制劑相比，TLR4下調(diào)程度有明顯差異(p＜0.01);此外，而NF-κB的蛋白表達(dá)兩組之間也有明顯差異(p＜0.05)，Sirt1蛋白表達(dá)兩組間而無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　(1)高效液相色譜法可以用來(lái)進(jìn)行中藥復(fù)方制劑有效成分的分析;
　　(2)給予SD大鼠腹腔注射

18、VD3聯(lián)合高脂飲食可以用來(lái)作為內(nèi)皮損傷動(dòng)物模型的造模方法;
　　(3)“抗栓一號(hào)”中藥復(fù)方可以改善高脂誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷大鼠血清中的血脂水平，降低TC、TG、LDL-c，升高HDL-c來(lái)緩解內(nèi)皮損傷;
　　(4)“抗栓一號(hào)”中藥復(fù)方可以下調(diào)高脂誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷大鼠血清與ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞上清中的IL-1β，IL-6，IL-12，TNF-α水平，降低大鼠胸主動(dòng)脈中的IL-1β，IL-6，IL-12，TNF-α水平的表達(dá)，起