連翹酯苷A通過HMGB1-TLR4-NF-κB信號通路抗內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　存在于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），即內(nèi)毒素，具有很強(qiáng)的免疫刺激作用，可引起全身性的炎癥反應(yīng)，甚至是死亡率很高的膿毒癥休克和嚴(yán)重膿毒癥。HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路在內(nèi)毒素引起的炎癥反應(yīng)中起著重要作用，因此抑制此通路是抗內(nèi)毒素的一種可行的方法。
　　此前我們的研究發(fā)現(xiàn)連翹酯苷A（Forsythoside A，F(xiàn)TA）有明顯的抗內(nèi)毒素作用。本研究

2、旨在觀察連翹酯苷 A預(yù)處理對 LPS作用的巨噬細(xì)胞內(nèi)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響，及LPS作用后連翹酯苷A對的巨噬細(xì)胞內(nèi) HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響，探究連翹酯苷 A抗內(nèi)毒素作用與HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的關(guān)系，以期為連翹酯苷A抗內(nèi)毒素的機(jī)制及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1. LPS對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白表達(dá)和釋放的影響
　　1.1實(shí)驗(yàn)分

3、組：實(shí)驗(yàn)共分為4組，分別為Control組，LPS100、200、300 ng/ml組，均常規(guī)培養(yǎng)24 h。
　　1.2.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測：①Western blot法檢測各組細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達(dá)；②ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HMGB1的含量。
　　2. FTA預(yù)處理對LPS作用的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路及炎癥因子分泌的影響
　　2.1.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為(1)Con

4、trol組，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h；(2)LPS組，加入LPS200 ng/ml，培養(yǎng)24 h；(3-5)連翹酯苷A低、中、高劑量+LPS組，分別加入FTA80、160、320μg/ml預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞2 h后，再給予LPS200 ng/ml，培養(yǎng)24 h；(6)連翹酯苷A高劑量組，加入FTA320μg/ml，培養(yǎng)24 h。
　　2.2.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測：①RT-PCR方法檢測各組細(xì)胞內(nèi) HMGB1和 TLR4 mRNA的表

5、達(dá)；②Western blot法檢測各組細(xì)胞內(nèi)HMGB1總蛋白和漿/核蛋白的表達(dá)，及TLR4和胞漿/核NF-κB蛋白的表達(dá)；③ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 HMGB1、TNF-α和 IL-6的含量；④硝酸還原酶法檢測各組細(xì)胞上清液中NO的含量；⑤免疫熒光法觀察(1)(2)(5)(6)組中細(xì)胞HMGB1蛋白的分布情況。
　　3. FTA預(yù)處理對HMGB1作用的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路及炎

6、癥因子分泌的影響
　　3.1.實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為(1)Control組，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)24 h；(2)HMGB1組加入HMGB12μg/ml培養(yǎng)24 h；(3-5)連翹酯苷A低、中、高劑量+HMGB1組分別加入FTA80、160、320μg/ml預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞2 h后，再給予HMGB12μg/ml，培養(yǎng)24 h；(6)連翹酯苷A高劑量組，加入FTA320μg/ml培養(yǎng)24 h。
　　3.2.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測：①Wes

7、tern blot法檢測各組細(xì)胞內(nèi)HMGB1總蛋白和漿/核蛋白的表達(dá)，及TLR4和胞漿/核NF-κB蛋白的表達(dá)；②ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中 TNF-α和 IL-6的含量；③硝酸還原酶法檢測各組細(xì)胞上清液中NO的含量；④免疫熒光法觀察(1)(2)(5)(6)組中細(xì)胞HMGB1蛋白的分布情況。
　　4. LPS作用后FTA對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路及炎癥因子分泌的影響
　　4.1.實(shí)

8、驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分為(1)Control組，細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)；(2)LPS組，加入LPS200 ng/ml，培養(yǎng)24 h；(3)LPS+連翹酯苷A高劑量0、2、6、12 h組，加入LPS200 ng/ml培養(yǎng)24 h，期間分別在0、2、6、12 h時(shí)給予FTA320μg/ml。
　　4.2.各項(xiàng)指標(biāo)的檢測：①Western blot法檢測各組細(xì)胞中HMGB1、TLR4和胞漿/核NF-κB蛋白的表達(dá)；②ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中H

9、MGB1、TNF-α和IL-6的含量；③硝酸還原酶法檢測各組細(xì)胞上清液中NO的含量。
　　研究結(jié)果：
　　1. LPS對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白表達(dá)和釋放的影響
　　不同濃度的LPS作用RAW264.7細(xì)胞24 h，各組HMGB1蛋白表達(dá)及胞外水平均高于對照組（P<0.01，P<0.05），其中200 ng/ml LPS組高于其余組。
　　2. FTA預(yù)處理對LPS作用的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB

10、1/TLR4/NF-κB信號通路及炎癥因子分泌的影響
　　LPS組中，HMGB1表達(dá)、胞漿遷移、胞外水平及TLR4表達(dá)、NF-κB蛋白的胞核遷移率，和細(xì)胞培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-6和 NO的含量明顯高于對照組（P<0.01）。在LPS作用下，F(xiàn)TA預(yù)處理組胞內(nèi)HMGB1表達(dá)、胞漿遷移、胞外水平及TLR4表達(dá)、NF-κB蛋白的胞核遷移率，和細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和NO的含量明顯低于LPS組（P<0.01，P<0.0

11、5），且與FTA呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。
　　3. FTA預(yù)處理對HMGB1作用的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路及炎癥因子分泌的影響
　　HMGB1組中，HMGB1表達(dá)、胞漿遷移及TLR4表達(dá)、NF-κB蛋白的胞核遷移率，和細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和NO的含量明顯高于對照組（P<0.01）。在HMGB1作用下，F(xiàn)TA預(yù)處理組胞內(nèi)HMGB1表達(dá)、胞漿遷移及TLR4表達(dá)、NF-κB蛋白的

12、胞核遷移率，和細(xì)胞培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-6和 NO的含量明顯低于HMGB1組（P<0.01，P<0.05），且與FTA呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。
　　4. LPS作用后FTA對RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路及炎癥因子分泌的影響
　　LPS組中，HMGB1表達(dá)、胞外水平及TLR4表達(dá)、NF-κB蛋白的胞核遷移率，和細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和NO的含量明顯高于對照組（P<0.01）

13、。在LPS作用細(xì)胞后給予FTA組中：(1)0 h組中HMGB1表達(dá)、胞外水平及TLR4表達(dá)、NF-κB蛋白的胞核遷移率，和細(xì)胞培養(yǎng)上清中 TNF-α、IL-6和 NO的含量明顯低于LPS組（P<0.01）；(2)2 h組中HMGB1胞外水平、TLR4表達(dá)、NF-κB蛋白的胞核遷移率，和細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-6和NO的含量明顯低于LPS組（P<0.01）；(3)6 h組中HMGB1胞外水平、TLR4表達(dá)和細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-6的