白藜蘆醇通過抑制TLR4信號通路抗IL-1β誘導(dǎo)的人骨性關(guān)節(jié)炎的體外實驗研究.pdf

1、骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)又稱骨關(guān)節(jié)病，是一種常見的慢性關(guān)節(jié)病，主要是以關(guān)節(jié)軟骨退變和繼發(fā)的骨質(zhì)增生為特征。隨著年齡的增大，OA患病率迅速上升，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，OA在女性患病率中占第四位，在男性患病率中占第八位，我國60歲以上者膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病率高達(dá)49％。OA一般從關(guān)節(jié)軟骨起病，影響整個關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)，包括軟骨下骨、韌帶、滑膜、關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)外肌肉，最終因關(guān)節(jié)軟骨全部脫失而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失，是老年人關(guān)節(jié)疼痛和致殘

2、的主要原因。
　　造成OA的原因有很多，包括損傷、軟骨結(jié)構(gòu)和功能的喪失、促炎性和抗炎性信號傳導(dǎo)途徑的失衡等。研究發(fā)現(xiàn)，OA患者在其關(guān)節(jié)軟骨和滑膜成纖維細(xì)胞中有Toll樣受體（Toll like receptors，TLRs）的表達(dá)，且TLR4是軟骨細(xì)胞中TLRs的主要受體形式。TLR4是天然免疫受體家族中的一員，能誘導(dǎo)炎癥的發(fā)生。以往研究顯示，在OA軟骨和滑膜損傷區(qū)域TLR4表達(dá)升高，TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與關(guān)節(jié)軟骨及滑膜損

3、傷過程，因而可以推測OA的發(fā)生、發(fā)展可能與TLR4及其下游信號通路所介導(dǎo)的固有免疫反應(yīng)密切有關(guān)，根據(jù)銜接的蛋白不同，TLR4可分為髓樣分化蛋白88(Myeloid differentiation factor88，MyD88)依賴性及非依賴性信號通路。但是TLR4信號通路在OA發(fā)生發(fā)展中的作用機制還不十分清楚。
　　迄今為止還沒有完全治愈OA的措施，理想的OA治療目標(biāo)是改善癥狀，減少疼痛和炎癥，預(yù)防關(guān)節(jié)退變，維持關(guān)節(jié)功能。但是，大

4、多數(shù)藥物治療方法都存在嚴(yán)重的副反應(yīng)，如增加胃腸道或心血管不良事件的風(fēng)險等。而某些來源于食物的營養(yǎng)制品則對慢性病具有預(yù)防和治療作用，因其幾乎無毒副作用成為預(yù)防和治療OA非常有應(yīng)用前景的物質(zhì)。白藜蘆醇(Resveratrol，RES)是一種植物多酚類物質(zhì)，在葡萄皮、漿果和堅果中含量很多，具有抗炎、抗氧化、抑制細(xì)胞凋亡等作用。一些研究顯示，在體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)及OA動物模型中，RES可以通過抑制凋亡、抗炎和抗氧化作用發(fā)揮抗OA效應(yīng)。但RES對O

5、A作用的確切機制還未闡明。在對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的研究中發(fā)現(xiàn)RES能抑制TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)。Hyung S.等研究發(fā)現(xiàn)RES主要是通過抑制TLR4信號通路中的信號運輸抑制劑響應(yīng)蛋白(transport inhibitor response protein，TIR)結(jié)構(gòu)域接頭分子抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB的活化而發(fā)揮抗炎作用。我們在前期對肥胖的OA患者軟骨細(xì)胞進(jìn)行的體外實驗研究中也發(fā)現(xiàn)RES可以抑制TLR4、NF-κB mR

6、NA的表達(dá)。
　　綜上所述，本研究擬選擇OA患者的膝、髖關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察白藜蘆醇對退變的OA軟骨細(xì)胞的作用;通過檢測TLR4/MyD88依賴性及非依賴性信號通路相關(guān)的基因及蛋白表達(dá)探討RES抗OA的作用機制。為闡明OA的發(fā)病機制及探索OA的營養(yǎng)防治措施提供實驗依據(jù)。
　　目的：
　　探討RES通過TLR4/MyD88依賴性和/或非依賴性信號通路對IL-1β誘導(dǎo)的人骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的作用，為探索OA的營養(yǎng)

7、防治措施提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　取因OA而行膝、髖關(guān)節(jié)置換的關(guān)節(jié)軟骨，采用兩步酶消化法分離培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，至第3代使用。應(yīng)用MTS法測定RES(0～200μmol/L)對加/不加IL-1β處理的軟骨細(xì)胞增殖活力的影響。然后采用RES（0～200μmol/L）處理預(yù)先經(jīng)過IL-1β孵育的軟骨細(xì)胞。ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基上清中MMP-13、IL-6的水平。Real-time PCR及Western

8、blot法檢測軟骨細(xì)胞TLR4、MyD88、TRIF、TRAF6 mRNA及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　一、軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
　　5ml的軟骨組織經(jīng)兩步酶消化后可獲得2～4×105/ml的軟骨細(xì)胞。原代軟骨細(xì)胞24 h后貼壁，細(xì)胞呈三角形或多角形，2周左右細(xì)胞融合成層。傳代后，細(xì)胞貼壁時間較原代細(xì)胞短，增殖速度快，約7-8天鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底，細(xì)胞形態(tài)與原代沒有明顯差異。
　　二、RES與IL-1對細(xì)胞活性影

9、響
　　DMSO對細(xì)胞活力無明顯影響(P＞0.05);與DMSO溶劑組相比，RES(6.25、12.5μmol/L)處理24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞活力明顯增強(P＜0.05)，RES(50～200μmol/L)處理24h、48h、72h后，細(xì)胞活力無明顯差異(P＞0.05);與DMSO溶劑組相比，RES（25μmol/L）處理48 h后，細(xì)胞活力明顯增強(P＜0.05);與DMSO溶劑組相比，IL-1β組細(xì)胞活力明顯降低

10、(P＜0.05);與IL-1β組相比，在RES（6.25～50μmol/L）處理24h、48h、72h后可顯著改善IL-1β誘導(dǎo)的細(xì)胞活力的抑制(P＜0.05)。
　　三、不同濃度RES對IL-1β誘導(dǎo)的不同時間OA軟骨細(xì)胞分泌MMP-13、IL-6水平的影響
　　加入IL-1β誘導(dǎo)后，培養(yǎng)基上清中MMP-13、IL-6水平明顯增加(P＜0.01);相比IL-1β誘導(dǎo)組，RES（6.25～200μmol/L）處理后，MMP-

11、13、IL-6水平均顯著降低(P＜0.01)。
　　四、不同濃度RES對IL-1β誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞TLR4、MyD88、TRIF、TRAF6 mRNA以及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響
　　加入IL-1β誘導(dǎo)后，軟骨細(xì)胞TLR4、MyD88、TRIF、TRAF6 mRNA以及蛋白質(zhì)表達(dá)明顯增加(P＜0.05);相比IL-1β誘導(dǎo)組，RES在不同的濃度處理后，TLR4、MyD88、TRIF、TRAF6 mRNA以及蛋白表達(dá)有顯著降低(P＜