TLR4通過(guò)p38-Il-1β信號(hào)通路參與SMIR誘導(dǎo)持續(xù)性術(shù)后疼痛的機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　持續(xù)性術(shù)后疼痛嚴(yán)重影響患者術(shù)后的生活質(zhì)量，目前已經(jīng)成為一個(gè)重要的臨床問(wèn)題。然而，持續(xù)性術(shù)后疼痛的機(jī)制仍不明了。本研究的目的是闡明背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia,DRG）中Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)及其與p38和IL-1β信號(hào)通路的相互作用對(duì)持續(xù)性術(shù)后疼痛的影響。
　　方法:
　　1.檢測(cè)SMIR術(shù)后大鼠機(jī)械撤足閾值(paw withdrawal

2、threshold，PWT)的變化，及大鼠DRG中TLR4表達(dá)情況。
　　1.1 用Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠行皮膚肌肉切口牽開(kāi)術(shù)(skin and muscleincision and retraction，SMIR)。SMIR術(shù)前1天及術(shù)后第1、5、10、20天檢測(cè)大鼠手術(shù)側(cè)和手術(shù)對(duì)側(cè)后足的PWT。
　　1.2 SMIR術(shù)前1天及術(shù)后1、5、10、20天取大鼠術(shù)側(cè)L3、L4 DRG，檢測(cè)TLR4蛋白水平

3、。
　　1.3 SMIR術(shù)后第10天取術(shù)側(cè)L3、L4 DRG，免疫熒光檢測(cè)TLR4所表達(dá)細(xì)胞類(lèi)型。
　　2.觀察SMIR術(shù)后大鼠DRG中MAPKs家族成員變化情況。
　　2.1 分別于SMIR術(shù)前1天及術(shù)后第1、5、10、20天取大鼠術(shù)側(cè)L3、L4 DRG，檢測(cè)MAPKs家族成員磷酸化水平。
　　2.2 SMIR術(shù)前30min至術(shù)后第10天每天鞘內(nèi)分別注射不同劑量p38 MAP激酶抑制劑SB203580（1μg、

4、10μg、50μg）及相同體積的溶劑，觀察大鼠PWT變化。在未手術(shù)組(Naive)鞘內(nèi)連續(xù)注射SB20358010μg作為對(duì)照，觀察其PWT變化。
　　3.觀察SMIR術(shù)后DRG中TLR4對(duì)PWT影響極其與p-p38之間關(guān)系
　　3.1 從SMIR術(shù)前30min至術(shù)后第10天每天鞘內(nèi)分別注射不同劑量TLR4拮抗劑LPS-RS（5μg、25μg、50μg）及相同體積的溶劑，觀察大鼠PWT變化。在未手術(shù)組(Naive)鞘內(nèi)連續(xù)注

5、射LPS-RS25μg作為對(duì)照，觀察其PWT變化。
　　3.2 SMIR術(shù)后第10天取術(shù)側(cè)DRG，免疫熒光檢測(cè)TLR4與p-p38的表達(dá)位置。
　　3.3 從SMIR術(shù)前30min至術(shù)后第10天每天鞘內(nèi)分別注射LPS-RS25μg，于第10天取大鼠DRG，檢測(cè)p-p38蛋白水平。
　　4.觀察SMIR術(shù)后DRG中IL-1β蛋白水平，研究TLR4、p-p38對(duì)IL-1β影響。
　　4.1 分別于SMIR術(shù)前1天及術(shù)

6、后第1、5、10、20天取大鼠術(shù)側(cè)L3、L4 DRG，檢測(cè)IL-1β蛋白水平。
　　4.2 從SMIR術(shù)前30min至術(shù)后第10天每天鞘內(nèi)分別注射不同劑量IL-1受體拮抗劑IL-1ra（10μg、50μg、100μg）及相同體積的溶劑，觀察大鼠PWT變化。在未手術(shù)組(Naive)鞘內(nèi)注射IL-1ra50μg作為對(duì)照，觀察其PWT變化。
　　4.3 從SMIR術(shù)前30min至術(shù)后第10天每天鞘內(nèi)分別注射LPS-RS25μg、S

7、B20358010μg，于第10天取大鼠DRG，檢測(cè)IL-1β水平。
　　結(jié)果:
　　1.SMIR術(shù)后大鼠術(shù)側(cè)PWT降低，DRG中TLR4表達(dá)升高。
　　1.1 SMIR術(shù)后第5、10、20天，大鼠術(shù)側(cè)PWT與術(shù)前相比顯著下降(n=12，P＜0.05)。
　　1.2 SMIR術(shù)后第5、10、20天，術(shù)側(cè)L3、L4 DRG中TLR4表達(dá)水平與術(shù)前相比顯著升高（n=6，P＜0.05）。但是在SMIR術(shù)后第1天，TLR

8、4水平與術(shù)前相比無(wú)顯著改變。
　　1.3 免疫熒光染色顯示，TLR4與IB-4、NF-200（神經(jīng)元標(biāo)記物）存在共染，但與GFAP（膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物）無(wú)共染。
　　2.MAPKs家族成員中的p-p38在SMIR術(shù)后表達(dá)顯著升高，且影響大鼠PWT。
　　2.1 與術(shù)前相比，SMIR術(shù)后第5、10、20天，大鼠DRG中p-p38水平顯著升高(n=6，P＜0.05)。p-ERK及p-JNK水平卻無(wú)顯著改變。
　　2.2

9、SMIR術(shù)后第5、10、20天，鞘內(nèi)注射10μg、50μg SB203580組大鼠術(shù)側(cè)PWT與溶劑組相比顯著升高（n=12，P＜0.05）。1μg組與溶劑組相比，大鼠術(shù)后PWT無(wú)顯著改變。Naive組鞘內(nèi)注射10μg SB203580，其PWT無(wú)顯著改變。
　　3.TLR4拮抗劑LPS-RS可使SMIR術(shù)后PWT升高、p-p38下降。
　　3.1 SMIR術(shù)后第5、10、20天，應(yīng)用25μg、50μg LPS-RS組大鼠PW

10、T與溶劑相比顯著升高(n=12，P＜0.05)。5μg組與溶劑相比，大鼠PWT無(wú)顯著改變。Naive組鞘內(nèi)注射25μg LPS-RS，大鼠PWT無(wú)顯著改變。
　　3.2 免疫熒光染色顯示TLR4與p-p38共染。
　　3.3 在SMIR術(shù)后第10天，25μg LPS-RS組大鼠DRG中p-p38水平較SMIR組顯著降低(n=6，P＜0.05)。
　　4.SMIR術(shù)后TLR4和p38通路通過(guò)上調(diào)IL-1β表達(dá)，參與了SM

11、IR誘導(dǎo)的痛覺(jué)過(guò)敏。
　　4.1 SMIR術(shù)后第5、10、20天，大鼠術(shù)側(cè)L3、L4 DRG中IL-1β比術(shù)前顯著升高(n=6，P＜0.05)
　　4.2 SMIR術(shù)后第5、10、20天，50μg、100μg IL-1ra組大鼠術(shù)側(cè)PWT與溶劑組相比，顯著升高（n=12，P＜0.05）。10μg組與溶劑相比，大鼠術(shù)側(cè)PWT無(wú)顯著改變。Naive組鞘內(nèi)注射50μg IL-1ra，大鼠PWT無(wú)顯著改變。
　　4.3 在SM