miR-221-222對PI3K-AKT-mTOR信號通路的激活及其對多發(fā)性骨髓瘤的影響機制研究.pdf

1、本文分為兩個部分進行探討：
　　第一部分 miR-221/222作用于PTEN發(fā)揮對PI3K/AKT/mTOR信號通路的調控作用
　　目的：研究miR-221/222在不同人多發(fā)性骨髓瘤（MM）細胞系內的表達情況及其靶向作用于PTEN，從而發(fā)揮對PI3K/AKT/mTOR信號通路的調節(jié)作用。
　　方法：采用qRT-PCR法檢測人MM細胞系NCI-H929、U266、OPM-2、MM.1S、MM.1R、RPMI8226、

2、ARH-77等多個細胞系miR-221/222的表達情況；設計合成miR-221/222特異性模擬物miR-221/222 mimics和特異性抑制物miR-221/222 inhibitor，對miR221/222低表達細胞系（MM.1S）以及高表達細胞系（OPM-2等）分別轉染miR-221/222 mimics/inhibitor，實驗設置陰性對照轉染組、正常對照組、miR-221/222 mimics/inhibitor轉染組；

3、qRT-PCR法檢測轉染后miR-221/222表達量；PI3K活性定量檢測法檢測PI3K活性變化；Western blot檢測AKT、mTOR及p-AKT和p-mTOR蛋白的表達。
　　結果：（1）miR-221/222在OPM-2細胞系中高表達，MM.1S細胞系中低表達；（2）miR-221/222 mimics能在不影響其它非編碼小RNA表達的情況下有效的上調miR-221/222在細胞系MM.1S中的表達量；miR-221

4、/222 inhibitor則能有效的下調miR-221/222在MM.1R和OPM-2細胞系中的表達量；（3）上調miR-221/222后，PI3K活性、p-AKT和p-mTOR蛋白表達量明顯上調，總AKT和mTOR的表達量未見明顯變化；（4）相反，下調miR-221/222的表達量后，PI3K活性及p-AKT和p-mTOR表達明顯下調，總AKT和mTOR表達無明顯變化。
　　結論：異常過表達的miR-221/222可通過靶向作

5、用于PTEN基因從而上調PI3K活性，進而使下游AKT和mTOR的磷酸化水平上調，通過拮抗該異常表達的miR-221/222可降低PI3K/AKT/mTOR信號通路的磷酸化水平。
　　第二部分 miR-221/222靶向作用于PTEN發(fā)揮對PI3K/AKT/mTOR信號通路調控及其多發(fā)性骨髓瘤細胞的凋亡與周期影響
　　目的：利用表達/拮抗試驗觀察在人MM細胞系中不同miR-221/222表達情況對MM細胞凋亡及周期的影響，并

6、進一步探討其機制。
　　方法:設計合成miR-221/222特異性模擬物miR-221/222 mimics和特異性抑制物miR-221/222 inhibitor，用miR-221/222 mimics轉染MM.1S使其miR-221/222的表達水平上調，以及miR-221/222 inhibitor轉染 MM.1R使其miR-221/222表達水平下調，實驗設置陰性對照轉染組、正常對照組、miR-221/222 mimics

7、/inhibitor轉染組，轉染24小時后給予藥物（雷帕霉素）；qRT-PCR法檢測轉染后miR-221/222表達量；PI3K活性定量檢測法檢測PI3K活性變化情況；Western blot檢測miR-221/222表達量對AKT、mTOR等信號通路蛋白表達水平的影響；利用CCK-8檢測miR-221/222表達量對MM細胞系的增殖影響；采用Annexin VFITC/PI雙染法流式細胞儀檢測miR-221/222過表達或抑制對MM細

8、胞凋亡的影響；采用碘化丙啶（PI）單染法流式細胞儀檢測miR-221/222過表達量對MM細胞周期的影響。
　　結果：（1）下調miR-221/222的表達可以明顯抑制MM.1R細胞增殖能力，能誘導MM細胞凋亡，并促其向S期轉變；（2）上調miR-221/222的表達后能促進MM.1S細胞的增殖，減少其凋亡,并誘導其向G0/G1期轉變；（3）下調miR-221/222聯合PI3K/AKT/mTOR通道抑制劑（雷帕霉素）作用于MM細

9、胞系可以更有效地抑制腫瘤細胞的增殖，并且能夠減低藥物的IC50；（4）雷帕霉素不僅可以作為mTOR的抑制劑，同時也可以抑制PI3K的活性，從而誘導MM細胞凋亡；
　　結論：沉默miR-221/222的表達能夠抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路的激活，使其磷酸化水平降低，從而抑制骨髓瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡以及阻滯細胞周期，最終抑制骨髓瘤細胞的生長；此外，下調miR-221/222表達水平能減低抗MM藥物的IC50，從而避免大劑