TPMT SNP與硫嘌呤藥物不良反應(yīng)相關(guān)性的系統(tǒng)評價及其檢測方法的構(gòu)建.pdf

1、硫嘌呤類藥物，包括硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤及其前體藥物硫唑嘌呤，于上世紀50年代由Elion和Hitchings首先發(fā)現(xiàn)。硫鳥嘌呤和6-巰基嘌呤用于炎癥性腸病穩(wěn)定期的誘導(dǎo)和維持治療，同時也是治療兒童急性淋巴細胞白血病最為廣泛應(yīng)用的藥物之一。硫唑嘌呤則主要用于自身免疫性疾病及器官移植后排斥反應(yīng)的治療。硫嘌呤類藥物的臨床療效和藥物不良反應(yīng)存在很大的個體差異，因此如何合理、個體化、安全地使用硫嘌呤類藥物進行治療就具有非常重要的臨床意義。

2、　　巰基嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶(Thiopurine Methyltransferase，TPMT)是硫嘌呤類藥物的在體內(nèi)代謝的關(guān)鍵酶，其活性的高低可以直接影響該類藥物的活性代謝產(chǎn)物6-硫代鳥嘌呤核苷酸在細胞內(nèi)的蓄積濃度，進而影響該類藥物的臨床療效和藥物不良反應(yīng)。TPMT存在明顯的遺傳多態(tài)性和種族地域差異，亞洲作是七大洲中人口最多，面積最大的一個洲，對TPMT基因型在亞洲人群中的分布沒有一個綜合全面的匯編;此外，中國是多民族國家，各民族的遺傳背

3、景、環(huán)境、生活習(xí)慣和生活地域有些不同，也缺少全面、細化的TPMT基因型分布。截止目前為止，盡管有不少研究調(diào)查了TPMT基因突變和硫嘌呤類藥物導(dǎo)致的藥物不良反應(yīng)之間的相關(guān)性，但是結(jié)論不一致，TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物導(dǎo)致的藥物不良反應(yīng)之間是否具有相關(guān)性仍然存在爭議?，F(xiàn)行的TPMT基因型/單核苷多態(tài)性比較常用的檢測方法都存在一定的局限性，無法滿足TPMT基因型的復(fù)雜性和多樣性的要求。
　　鑒于此，本研究首先采用綜合查找文獻的方法對

4、TPMT基因型在亞洲人群和中國人群中的分布做總結(jié)匯編，為臨床硫嘌呤類藥物個體化使用提供重要的理論基礎(chǔ)和為課題下一步實施提供數(shù)據(jù)支撐;在此基礎(chǔ)上，采用通過增大樣本量來增加統(tǒng)計學(xué)功效進而可以解決各個分散研究結(jié)論不一致的系統(tǒng)評價與Meta分析的方法對TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物相關(guān)的藥物不良反應(yīng)相關(guān)性存在的爭議問題進行解決，進一步明確檢測TPMT基因突變的重要意義。隨后，初步構(gòu)建一種基于聚合連接探針的TPMT單核苷多態(tài)性的新型檢測方法，以期

5、能實現(xiàn)對多個TPMT SNP簡便、高通量、單管并行檢測的目的。
　　目的：
　　(1)獲取TPMT基因型在亞洲人群和中國人群中的具體分布，為課題的下一步實施提供數(shù)據(jù)支撐。
　　(2)通過系統(tǒng)綜述和Meta分析的方法進一步明確炎癥性腸病患者、自身免疫疾病患者TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物不良反應(yīng)之間的相關(guān)性，了解服用硫嘌呤類藥物之前檢測TPMT基因型的必要性。
　　(3)初步構(gòu)建基于聚合連接探針的TPMT單核苷酸多

6、態(tài)性檢測方法。
　　方法：
　　(1)通過系統(tǒng)檢索PubMed、Excerpta Medica Database和Chinese BiomedicalDatabase等數(shù)據(jù)庫中有關(guān)TPMT基因型在亞洲人群和中國人群中分布的研究文獻，對TPMT基因型和等位基因在亞洲人群和中國人群中的分布做一整理歸納。檢索詞分別為“硫嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶”，“TPMT”，“Thiopurine S-methyltranferase”，“Polympo

7、rphism”，“Hepalotype”等。
　　(2)檢索了PubMed，Web of Science和Excerpta Medica Database三大數(shù)據(jù)庫關(guān)于炎癥性腸病患者和自身免疫疾病患者TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物不良反應(yīng)之間相關(guān)性的文獻。納入的文獻比較了服用硫嘌呤類藥物后發(fā)生藥物不良反應(yīng)和沒有發(fā)生藥物不良反應(yīng)TPMT突變基因型的分布。提取相關(guān)數(shù)據(jù)并采用Revman5.3軟件計算對應(yīng)的95％置信區(qū)間。
　　(

8、3)設(shè)計并合成針對TPMT單核苷多態(tài)性的聚合連接探針;對通用引物、聚合酶、連接酶、dNTP濃度等反應(yīng)體系進行優(yōu)化，確定基于聚合連接探針的TPMT單核苷酸多態(tài)性的最佳反應(yīng)條件和反應(yīng)體系。
　　結(jié)果：
　　(1)根據(jù)制定的納入標準，共有來自16個國家/地區(qū)的68篇文章是關(guān)于TPMT基因型在亞洲人群中的分布，納入人數(shù)共18，234人。亞洲人群中TPMT突變基因型百分比為3.54％，TPMT*1/*3C和TPMT*1/*3A是主要的

9、突變基因型，分別占總體突變基因型的69.72％和16.15％;突變基因型純合子在亞洲人群中并不多見，在所納入的18，234人中，只發(fā)現(xiàn)了11例突變基因型純合子和1例突變基因型復(fù)合雜合子;TPMT突變等位基因總體百分比為1.80％，TPMT*3C占總體突變等位基因的70.93％(66/657)，其次是TPMT*3A;進一步明確了TPMT*3C只是東亞和東南亞最常見的突變型等位基因。
　　(2)共有30篇中文文獻和14篇英文文獻關(guān)于T

10、PMT基因型在中國人群中的分布，納入10，458人。中國人群中TPMT基因型總體突變率為2.91％，主要的突變基因型為TPMT*1/*3C，TPMT*1/*3A;主要的突變等位基因為TPMT*3C，占總體突變等位基因的97.05％，TPMT*3A主要在哈薩克斯坦族和維吾爾族人群中發(fā)現(xiàn)的，在漢族人群中未發(fā)現(xiàn)TPMT*3A;目前針對少數(shù)民族TPMT基因型分布的研究較少，需要更多的研究來加以證實。
　　(3)炎癥性腸病患者TPMT基因突

11、變與硫嘌呤類藥物不良反應(yīng)的系統(tǒng)評價與Meta分析納入了14篇文獻，涉及的病例數(shù)達到2，206例。結(jié)果表明TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物導(dǎo)致的總體藥物不良反應(yīng)和骨髓毒性是明顯相關(guān)的，合并比值比（95％置信區(qū)間）分別是3.36(1.82-6.19)和6.67(3.88-11.47)。TPMT基因突變與其他的藥物不良反應(yīng)的發(fā)生沒有明顯相關(guān)性，如肝臟毒性作用、胰腺炎、腸胃不耐受、流感樣癥狀和皮膚反應(yīng)，合并比值比（95％置信區(qū)間）分別是1.27(

12、0.60-2.71)，0.97(0.38-2.48)，1.82(0.93-3.53),1.28(0.47-3.46)和2.32(0.86-6.25)。
　　(4)自身免疫疾病患者TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物不良反應(yīng)的系統(tǒng)評價與Meta分析納入了11篇文獻，涉及的病例數(shù)達到了651例。結(jié)果表明TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物導(dǎo)致的總體藥物不良反應(yīng)、骨髓毒性和腸胃不耐受呈顯著相關(guān)，合并比值比（95％置信區(qū)間）分別是3.12(1.48-

13、6.56)，3.76(1.97-7.17)和6.43(2.04-20.25)。TPMT基因突變與硫嘌呤類藥物導(dǎo)致的肝臟毒性作用沒有顯著相關(guān)性，合并比值比(95％置信區(qū)間)是2.86(0.32-25.86)。
　　(5)完成了針對TPMT*2，TPMT*3A～*3C的聚合連接探針的設(shè)計和合成，確定了TPMT單核苷酸多態(tài)性的檢測條件和反應(yīng)體系:通用引物為來自為噬菌體M13啟動子序列;聚合酶為沒有外切酶活性的Exo(-) pfu DNA

14、聚合酶;連接酶為Ligase-65;dNTP的濃度為2 mM; ABI3500片段分析的條件為POP4膠和36厘米毛細管。
　　結(jié)論：
　　(1)TPMT基因型在亞洲人群的分布不盡相同，進一步明確了基于TPMT基因型進行硫嘌呤類藥物治療的重要性。很多亞洲國家在藥物基因組學(xué)方面的研究不多，了解這些國家TPMT基因型的分布將有助于患者進行安全的硫嘌呤類藥物治療。
　　(2)我國是一個多民族的國家，各民族的遺傳背景、生活地域

15、、環(huán)境和生活習(xí)慣有些不同，目前針對少數(shù)民族TPMT基因多態(tài)性研究的較少，需要更多的研究來加以證實;根據(jù)我國不同地區(qū)和民族選擇性進行TPMT基因型檢測，不但可有效的指導(dǎo)硫嘌呤類藥物的個體化用藥，而且可節(jié)約醫(yī)療成本，減輕患者經(jīng)濟負擔。
　　(3)在炎癥性腸病患者中，TPMT基因突變與發(fā)生總體藥物不良反應(yīng)、骨髓毒性具有強相關(guān)性，而與肝臟毒性作用、腸胃不耐受、流感樣癥狀和皮膚反應(yīng)不具有相關(guān)性。在自身免疫疾病患者中，TPMT基因突變與發(fā)生總

16、體藥物不良反應(yīng)、骨髓毒性和腸胃不耐受具有顯著相關(guān)性，與肝臟毒性作用不具有相關(guān)性，該結(jié)果對開展硫嘌呤類藥物個體性用藥有一定的參考和指導(dǎo)意義。目前有不少臨床指南推薦和建議患者在服用該類藥物之前進行TPMT基因型的檢測，我們的研究結(jié)果也間接論證了在服用硫嘌呤類藥物之前檢測TPMT基因型的必要性和提供了循證醫(yī)學(xué)的依據(jù)。但有一點應(yīng)該強調(diào)，服藥前進行TPMT基因型的檢測不能替代目前的全血細胞計數(shù)監(jiān)測方法，兩者應(yīng)該合并使用才能最大化硫嘌呤類藥物療效和