冬凌草甲素通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞自噬活性提高NVP-BEZ235對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤效應(yīng).pdf

1、研究背景和目的:
　　PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中存在異常激活，并與預(yù)后密切相關(guān)；然而，NVP-BEZ235作為新型PI3K/mTOR雙靶點(diǎn)抑制劑，單獨(dú)應(yīng)用并不能有效誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。為增強(qiáng) NVP-BEZ235的抗腫瘤效應(yīng)，充分發(fā)揮其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值，有必要探索以 NVP-BEZ235為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療方案。冬凌草甲素（Oridonin，ORI）是從中草藥冬凌草中提取出來(lái)的貝殼杉烯二

2、萜類(lèi)天然化合物，可以作為一種輔助藥物顯著增強(qiáng)吉西他濱和伊馬替尼等多種化療藥物的抗腫瘤效應(yīng)。本研究采用冬凌草甲素與 NVP-BEZ235聯(lián)合方案處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞并構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤模型，觀察該聯(lián)合方案在體內(nèi)外水平對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤效應(yīng)，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1. CCK-8法和免疫印跡法分別檢測(cè)NVP-BEZ235對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；流式細(xì)胞術(shù)和免疫印跡法進(jìn)一步探討 NVP-BE

3、Z235抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制。
　　2. CCK-8、AO/EB雙熒光染色和免疫印跡法檢測(cè)冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用在體外水平對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響；Ki-67免疫組化和TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用在體內(nèi)水平對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞裸鼠移植瘤增殖和凋亡的影響。
　　3.免疫印跡法檢測(cè)冬凌草甲素與NVP-BEZ235單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬活性的影響。以pLKO

4、.1為載體，構(gòu)建針對(duì)自噬基因Beclin-1的shRNA干擾質(zhì)粒，利用293T細(xì)胞包裝生產(chǎn)病毒液，感染SHSY-5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，免疫印跡法驗(yàn)證靶基因的沉默效果；AnnexinV-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用對(duì)Beclin-1基因敲減的SHSY-5Y細(xì)胞凋亡的影響，免疫印跡法進(jìn)一步檢測(cè)冬凌草甲素與 NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用對(duì) Beclin-1基因敲減的SHSY-5Y細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)

5、蛋白表達(dá)水平的影響。
　　研究結(jié)果:
　　1. NVP-BEZ235可以顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，并且呈明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性；但其并不能有效誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。流式細(xì)胞術(shù)顯示神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞經(jīng)NVP-BEZ235處理后G0/G1期細(xì)胞數(shù)顯著增多，S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)明顯減少；且G1期細(xì)胞周期素cyclinD1和cyclinE1表達(dá)減少。
　　2.冬凌草甲素和NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用可以更顯著地抑制神經(jīng)

6、母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，并有效誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡；冬凌草甲素和 NVP-BEZ235聯(lián)合用藥組裸鼠移植瘤體積和質(zhì)量相對(duì)于對(duì)照組和單藥處理組明顯減小，Ki-67陽(yáng)性增殖細(xì)胞比例顯著降低，TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞比例明顯增多。
　　3.冬凌草甲素和NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡伴隨著細(xì)胞自噬活性的顯著增強(qiáng)；shRNA干擾自噬基因 Beclin-1表達(dá)后，神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞整體自噬活性顯著降低，細(xì)胞經(jīng)冬凌草甲素和 NV

7、P-BEZ235聯(lián)合處理后凋亡細(xì)胞比率明顯減小，凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)減少。
　　研究結(jié)論:
　　1. NVP-BEZ235單獨(dú)應(yīng)用可以通過(guò)G1期阻滯作用顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，但并不能誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。
　　2.冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用可以有效誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡，在細(xì)胞和動(dòng)物水平上對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤產(chǎn)生顯著的抗腫瘤效應(yīng)。
　　3.冬凌草甲素與NVP-BEZ235聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤