水痘-帶狀皰疹病毒誘導人神經(jīng)母細胞瘤細胞的自噬作用觀察.pdf

1、水痘—帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)屬α皰疹病毒亞科，首次感染人體后能引起水痘或呈隱性感染狀態(tài)，在對人體的初次感染后，病毒沿感覺神經(jīng)侵入脊神經(jīng)節(jié)或腦神經(jīng)感覺神經(jīng)節(jié)內(nèi)并潛伏于其中。當機體免疫力低下時病毒被再激活而引起帶狀皰疹。VZV具有親神經(jīng)性，可引起帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛(postherpetic neuralgia，PHN)，PHN在臨床上十分棘手，給患者的心理和生理帶來嚴重影響。自噬是一種高度保守的

2、細胞內(nèi)降解途徑，其依賴溶酶體途徑降解細胞內(nèi)受損的細胞器和錯誤折疊的蛋白質以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。自噬也參與到固有免疫和先天性免疫清除入侵病原體的應答過程中。近年來研究表明細胞可以激活自噬來控制人類皰疹病毒感染。然而人類皰疹病毒進化出多種機制來逃避、抑制、破壞甚至利用細胞自噬。本文觀察了VZV在人神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SHSY5Y)中培養(yǎng)及增殖的特點和VZV感染SHSY5Y細胞后的生物學效應，探討感染后自噬發(fā)生的規(guī)律，為有效地干預和治療VZV感染

3、提供新思路。
　　目的:
　　本研究的目的是探討VZV在SHSY5Y細胞中培養(yǎng)及增殖的特點，觀察VZV感染SHSY5Y細胞后的生物學效應，探討感染后自噬發(fā)生的規(guī)律和特點，為有效地干預和治療VZV感染提供新思路。
　　方法:
　　1.于普通倒置顯微鏡和電子顯微鏡下觀察被感染細胞的形態(tài)變化，利用CCK-8法檢測VZV感染對細胞增殖的影響;比較不同感染復數(shù)(MOI)和不同濃度胎牛血清(FBS)維持液對病毒增殖的影響;<

4、br>　　2.利用單丹（磺）酰戊二胺(MDC)染色法檢測自噬體的形成，通過流式細胞術測定VZV感染細胞后不同時間點(24h、48h、72h、96h)自噬相關蛋白微管結合蛋白-1輕鏈-3B(microtubule-associated protein1 light chain3B，MAP1LC3B，又稱為LC3B)和SQSTM1/p62的表達情況;
　　3.提取VZV病毒中的DNA，利用熒光定量PCR檢測VZV感染細胞后不同時間點(

5、24h、48h、72h、96h)的病毒DNA拷貝數(shù)。
　　結果:
　　1.普通倒置顯微鏡下觀察細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，從24至96h，細胞病變數(shù)量增加和病變程度加重。電鏡觀察顯示:感染48h后核染色質固縮、濃染，線粒體肥大及增生，胞質空泡化和自噬小體形成，可見包裝成熟的病毒顆粒。CCK-8法提示VZV感染24h后細胞增殖被抑制，各實驗組存活率與對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。在2

6、％胎牛血清的維持液中用MOI為1的VZV感染SHSY5Y細胞，能收獲較高滴度的病毒。
　　2.MDC染色法顯示VZV感染細胞后自噬體數(shù)量增加，流式細胞術檢測結果表明VZV感染組的自噬相關蛋白LC3B-II蛋白的表達增加，而p62蛋白的表達出現(xiàn)下降，與正常對照組比較均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　3.熒光定量PCR結果表明VZV感染SHSY5Y細胞后72h的DNA拷貝數(shù)明顯高于其余三組(24h、48h、96h)(P＜0.