白黎蘆醇體外抑制水痘—帶狀皰疹病毒作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:
　　 1、應(yīng)用構(gòu)建的水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)報(bào)告細(xì)胞系MV9G進(jìn)一步研究白黎蘆醇體外抑制VZV的作用機(jī)制。
　　 2、進(jìn)一步驗(yàn)證應(yīng)用VZV報(bào)告細(xì)胞MV9G篩選抗VZV藥物并研究其作用機(jī)制的可行性。
　　 方法:
　　 1、將無細(xì)胞VZV直接感染MV9G細(xì)胞（CFVs直接感染）或?qū)Ъ?xì)胞VZV與MV9G細(xì)胞共培養(yǎng)（CAVs共培養(yǎng)）以激發(fā)MV9G細(xì)胞表達(dá)報(bào)告基因螢火蟲熒光素酶。
　　 2、

2、在CFVs直接感染前或CAVs共培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)加入白黎蘆醇，通過比較藥物對(duì)CFVs或CAVs激發(fā)熒光素酶的抑制強(qiáng)度分析白黎蘆醇直接滅活病毒、抑制病毒粘附和穿透、抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制及其時(shí)間點(diǎn)和可逆性。
　　 3、通過比較藥物作用前后VZV即刻早期蛋白62(IE62) mRNA拷貝數(shù)和IE62表達(dá)強(qiáng)度變化分析白黎蘆醇對(duì)IE62轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的抑制作用。
　　 結(jié)果:
　　 1、白黎蘆醇＞30.0μg/mL時(shí)MV9G細(xì)胞

3、三磷酸腺苷(ATPs)含量隨藥物濃度升高而逐漸降低，ATPs降低50％時(shí)白黎蘆醇濃度(CD50)約60.3μg/mL。
　　 2、無細(xì)胞VZV(CFVs)與白黎蘆醇（25.0μg/mL）預(yù)混37℃水浴孵育2h后直接感染MV9G細(xì)胞，CFVs激發(fā)熒光素酶下降50％。
　　 3、MV9G細(xì)胞在含白黎蘆醇培養(yǎng)基中37℃孵育2h后直接感染CFVs，CFVs激發(fā)熒光素酶隨藥物濃度升高而逐漸降低，但4℃孵育時(shí)無顯著變化。
　　

4、 4、在帶細(xì)胞VZV(CAVs)共培養(yǎng)中加入白黎蘆醇時(shí)CAVs激發(fā)熒光素酶顯著降低，藥物抑制熒光素酶50％時(shí)濃度(IC50)約8.7μg/mL。
　　 5、分別在CAVs共培養(yǎng)3、6、9、12、24、30和36h時(shí)加入白黎蘆醇，3h～24h加藥各組CAVs激發(fā)熒光素酶均顯著高于對(duì)照組，但1h、30h和36h加藥組與對(duì)照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6、CAVs共培養(yǎng)時(shí)撤除白黎蘆醇后CAVs激發(fā)熒光素酶顯著高于撤藥前，尤

5、以24h和72h撤藥組明顯。VZV IE62 mRNA拷貝數(shù)和IE62抗體陽性細(xì)胞數(shù)隨藥物作用時(shí)間延長而逐漸將低。
　　 結(jié)論:
　　 1、白黎蘆醇細(xì)胞毒性較強(qiáng)，MV9G細(xì)胞可耐受最高濃度為30.0μg/mL。
　　 2、白黎蘆醇可部分滅活CFVs。
　　 3、白黎蘆醇抑制CFVs穿透MV9G細(xì)胞膜但對(duì)CFVs粘附MV9G細(xì)胞膜無影響。
　　 4、白黎蘆醇以濃度依賴方式可逆性抑制CAVs在MV9G