應用水痘-帶狀皰疹病毒報告細胞系定量帶細胞病毒的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)ORF62表達質(zhì)粒，并應用VZV報告細胞系MV9G定量帶細胞病毒(CAV)，以建立篩選抗VZV藥物并研究其作用機制的新方法。
　　 方法：
　　 1、以VZV疫苗株BKvOka基因組DNA為模板、PCR擴增獲得ORF62全序列后克隆到高效表達質(zhì)粒pCAGGS中構(gòu)建BKvOkaORF62表達質(zhì)粒pCAG-BKvOka62，再應用雙酶切和DNA測序法鑒定所構(gòu)建質(zhì)粒的正確性。
　　

2、 2、將倍比稀釋的BKvOka株感染MeWo細胞(含BKvOka株CAV)與MV9G細胞共培養(yǎng)72h后，分別用化學發(fā)光法檢測BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細胞表達的螢火蟲熒光素酶(RLU)、用間接免疫酶法染色并計數(shù)病毒蝕斑(focusnumbers)、用SYBRGreen熒光定量PCR法檢測病毒DNA拷貝數(shù)(DNAcopies)，分別計算RLU/病毒蝕斑數(shù)和RLU/病毒DNA拷貝數(shù)的比值，分析其相關性，并建立RLU-病毒蝕斑數(shù)、RLU

3、-病毒DNA拷貝數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)-病毒蝕斑數(shù)的標準曲線。在培養(yǎng)基中加入阿昔洛韋(ACV)以抑制病毒生長，再以相同方法建立ACV作用下RLU-病毒蝕斑數(shù)、RLU-病毒DNA拷貝數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)-病毒蝕斑數(shù)的標準曲線。
　　 3、將隨機稀釋的GSKvOka株感染MeWo細胞(含GSKvOka株CAV)與MV9G細胞共培養(yǎng)72h后，仍用上述方法檢測GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細胞表達的螢火蟲熒光素酶(RLU)、病毒蝕斑數(shù)

4、和病毒DNA拷貝數(shù)。再以MV9G細胞熒光素酶RLU為基數(shù)，根據(jù)繪制標準曲線時所得RLU/病毒蝕斑數(shù)和RLU/病毒DNA拷貝數(shù)比值推算GSKvOka株蝕斑數(shù)和DNA拷貝數(shù)，獲得病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)預測值，并將預測值與其實測值比較，以驗證應用MV9G細胞定量CAV的可行性。
　　 結(jié)果：
　　 1、通過將BKvOka株ORF62全序列克隆到pCAGGS表達質(zhì)粒構(gòu)建了VZVORF62重組表達質(zhì)粒pCAG-BKvOka6

5、2。經(jīng)雙酶切反應和DNA測序鑒定，克隆的ORF62片段與預期一致，VZVORF62表達質(zhì)粒pCAG-BKvOka62得以成功構(gòu)建。
　　 2、將倍比稀釋的BKvOka株CAV與MV9G細胞共培養(yǎng)72h后，BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細胞表達的熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(r=0.999，P＜0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(r=0.974，P＜0.01)，病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(r=0.979，

6、P＜0.01)，RLU/病毒蝕斑數(shù)=181.62，RLU/病毒DNA拷貝數(shù)=1.97×10-4。加入抗病毒藥物ACV后RLU與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(r=0.991，P＜0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(r=0.971，P＜0.01)，病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(r=0.936，P＜0.05)。
　　 3、將隨機稀釋的GSKvOka株CAV與MV9G細胞共培養(yǎng)72h后，GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細胞表達的熒光

7、素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(r=0.992，P＜0.01)、與病毒DNA拷貝數(shù)顯著相關(r=0.988，P＜0.01)，病毒DNA拷貝數(shù)與病毒蝕斑數(shù)顯著相關(r=0.966，P＜0.01)。根據(jù)GSKvOka株CAV激發(fā)MV9G細胞熒光素酶RLU值推算的病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)預測值與其實測值基本一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建BKvOka株ORF62表達質(zhì)粒pCAG-BKvOka62，為熒光定量PC

8、R法檢測VZVDNA提供了質(zhì)粒模板標準品，為進一步應用VZV報告細胞系定量CAV奠定了基礎。
　　 2、以已知量BKvOka株CAV與MV9G細胞共培養(yǎng)時，無論是否加入抗病毒藥物ACV，BKvOka株CAV激發(fā)MV9G細胞表達的螢火蟲熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)均顯著相關。以未知量GSKvOka株CAV與MV9G細胞共培養(yǎng)時CAV激發(fā)MV9G細胞表達的熒光素酶(RLU)與病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)仍顯著相關

9、。根據(jù)RLU推算出的病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)的預測值與其實測值基本一致。提示MV9G細胞與CAV共培養(yǎng)時受CAV激發(fā)表達熒光素酶RLU的變化可以反映病毒蝕斑數(shù)和病毒DNA拷貝數(shù)的變化。因此，應用MV9G細胞定量CAV是可行的。
　　 3、應用VZV報告細胞MV9G定量CAV克服了免疫酶染色法和熒光定量PCR法過程煩瑣、難客觀、易污染等缺點，具有簡便、快速、敏感、客觀和高通量的特點，為進一步建立抗VZV藥物篩選和作用機制研究方