Expansin和expansin-like蛋白及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、本論文首次對(duì)纖維素膨脹因子候選者expansin與木質(zhì)纖維素多糖水解酶的協(xié)同作用機(jī)制進(jìn)行了研究。我們選取了幾種真菌來源的在E.coli中異源表達(dá)的多糖水解酶，從多糖水解酶的水解活性、棉纖維的膨脹活性和α-expansin的黃瓜下胚軸細(xì)胞壁伸長(zhǎng)活性三個(gè)方面入手進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，α-expansin只能協(xié)同地促進(jìn)內(nèi)切木葡聚糖酶Cel12A水解CMC-Na的能力，而對(duì)其水解xyloglucan和β-glucan的能力沒有影響，同樣，α-

2、expansin對(duì)內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A水解多糖底物的能力也沒有影響。本課題的研究還首次發(fā)現(xiàn)了α-expansin可以協(xié)同地促進(jìn)果膠酶Pel1水解高甲基化果膠的能力達(dá)到30-71％。我們認(rèn)為α-expansin可以通過打斷多糖分子之間氫鍵的方式協(xié)同地促進(jìn)木質(zhì)纖維素多糖水解酶的水解活性。而對(duì)棉纖維的膨脹作用進(jìn)行定量檢測(cè)結(jié)果顯示，相對(duì)于被檢測(cè)的棉纖維總數(shù)，無論是α-expansin或是多糖水解酶處理后的棉纖維所產(chǎn)生的膨脹區(qū)域數(shù)量都不足以證明

3、其具有棉纖維膨脹活性。由于重組的內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A不能水解Xyloglucan，所以其對(duì)α-expansin細(xì)胞壁伸長(zhǎng)活性沒有影響；重組的內(nèi)切木葡聚糖酶Cel12A可以獨(dú)立地誘導(dǎo)細(xì)胞壁延遲伸長(zhǎng)且伸長(zhǎng)活性要大大高于α-expansin，低濃度的Cel12A同α-expansin共同作用的細(xì)胞壁伸長(zhǎng)活性同相同濃度的Cel12A單獨(dú)作用的伸長(zhǎng)活性沒有顯著差異，而高濃度的Cel12A同α-expansin共同作用的細(xì)胞壁伸長(zhǎng)活性甚至要略低于

4、相同濃度Cel12A單獨(dú)作用的伸長(zhǎng)活性,α-expansin的加入可以消除Cel12A誘導(dǎo)的細(xì)胞壁伸長(zhǎng)的延滯期；重組的果膠酶Pel1可以協(xié)同地促進(jìn)α-expansin的細(xì)胞壁伸長(zhǎng)活性達(dá)到49％，根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出以下結(jié)論：
　　 （1）木葡聚糖是expansin誘導(dǎo)的細(xì)胞壁伸長(zhǎng)現(xiàn)象中的關(guān)鍵分子。（2）expansin誘導(dǎo)的細(xì)胞壁伸長(zhǎng)活性取決于纖維素/木葡聚糖網(wǎng)絡(luò)的破壞程度。（3）以及包裹在纖維素/木葡聚糖網(wǎng)絡(luò)周圍的果膠基

5、質(zhì)的破壞程度。
　　 本論文對(duì)植物來源的α-expansin的異源重組表達(dá)進(jìn)行了研究。我們通過RT-PCR的方法克隆得到植物來源的兩個(gè)α-expansin蛋白的cDNA序列，并分別構(gòu)建到大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行重組表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，黃瓜來源的CsExpa1不能在大腸桿菌和畢赤酵母中重組表達(dá)；棉花來源的GhExp1基因不能在畢赤酵母中重組表達(dá)，雖然GhExp1基因能夠在大腸桿菌中有可溶性重組蛋白的表達(dá)，但是表達(dá)量很低且沒

6、有檢測(cè)到任何expansin蛋白的活性。由于大腸桿菌沒有對(duì)異源重組蛋白進(jìn)行翻譯后修飾的能力，我們認(rèn)為重組expansin蛋白的活性依賴于蛋白的翻譯后修飾，這可能是植物來源expansin蛋白至今難以實(shí)現(xiàn)異源重組表達(dá)的原因。
　　 本論文首次報(bào)道了從絲狀真菌Trichoderma reesei中克隆得到了一種新的expansin-like蛋白Tre1的全基因DNA和cDNA序列，并進(jìn)行了異源重組表達(dá)研究。
　　 我們根據(jù)前

7、期研究獲得的純化自纖維素酶復(fù)合物的expansin-like蛋白的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)了簡(jiǎn)并引物，分別通過RACE-PCR和反向PCR的方法克隆得到了編碼該蛋白的包含完整起始密碼子和終止密碼子的cDNA序列（1383bp）以及包含一個(gè)內(nèi)含子和polyA序列的基因組DNA序列（1725bp），通過對(duì)新基因序列的分析和數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果顯示克隆獲得的Tre1基因?yàn)槭状螆?bào)道的新基因，其蛋白序列包含一個(gè)完整的Glycosylhydrolase fami