骨形成蛋白-4和粘蛋白1在哮喘發(fā)生中的作用及其機制.pdf

1、研究背景:
　　過敏性哮喘是一種常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，常常表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的可逆的支氣管阻滯和炎癥。該病往往在患者童年即出現(xiàn)癥狀，其形成一般經(jīng)歷致敏期、潛伏期和激活期三個階段。過敏性哮喘的發(fā)生與患者遺傳背景存在高度相關(guān)。因此，確定可以影響過敏性哮喘發(fā)病的各個階段的蛋白，將有助于了解過敏性哮喘發(fā)生的機制和發(fā)展針對性的治療措施。實際上，越來越多的研究表明，不少基因的改變，會增加患哮喘的風(fēng)險。這些基因往往涉及調(diào)控呼吸道上皮細(xì)胞對外界刺激

2、反應(yīng)的敏感性（例如病毒和細(xì)菌感染，環(huán)境顆粒刺激等），或者調(diào)控免疫系統(tǒng)對致敏原的反應(yīng)敏感性。
　　骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是一組分泌型的多功能肽類生長因子，為轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β家族中最大的亞群（其它亞群包括TGF-β和activin）。除BMPl外，其余成員均在結(jié)構(gòu)上與TGF-β相似。BMPs以前體蛋白形式被合成，當(dāng)被剪切為有活性的成熟體BMPs并分泌至胞后，以同型或異型

3、二聚體形式與2種絲氨酸-蘇氨酸激酶受體（BMPR-I和BMPR-II）結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用，最終參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。BMPs在組織再生和修復(fù)中發(fā)揮著重要作用，能夠影響多種細(xì)胞的增殖、分化、遷移和凋亡。BMP4是BMPs亞型中重要的分子之一，在內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞等皆有表達(dá)。BMP-4在胚胎肺發(fā)育中起關(guān)鍵作用。近年來越來越多的報道認(rèn)為BMP4參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)控。人類哮喘病人氣道上皮組織BMP7的表達(dá)升高，表明BMPs家族可能參與

4、調(diào)控哮喘中肺部炎癥的發(fā)生。然而，至少一則報道認(rèn)為，在以卵清蛋白誘導(dǎo)的小鼠過敏性氣道炎癥模型中，雖然氣道上皮細(xì)胞出現(xiàn)BMP信號活化、BMPR-I表達(dá)明顯增加，肺組織中BMP2和BMP6顯著上調(diào)，而BMP4卻呈現(xiàn)下降。但針對哮喘病人的臨床研究表明，氣道上皮細(xì)胞中的BMP4在哮喘患者和正常人之間沒有區(qū)別。因此，目前關(guān)于BMP4在過敏性哮喘中的表達(dá)情況及功能仍然存在爭議。
　　除了分泌型蛋白可能參與調(diào)控哮喘的發(fā)生，鉚定在細(xì)胞表面的蛋白也可

5、能參與調(diào)控過敏性哮喘。粘蛋白1（Mucin1，Muc1）是一種主要分布在腺上皮細(xì)胞頂部，以及部分免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞表面的跨膜蛋白，由胞外區(qū)（EC區(qū)）、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)（CT區(qū)）構(gòu)成。其CT區(qū)分布有酪氨酸磷酸化位點、GSK3β結(jié)合位點和β-catenin結(jié)合位點。這些位點的磷酸化或和配體結(jié)合，可以引起下游細(xì)胞信號的改變。近年來，MUC1被發(fā)現(xiàn)參與了肺部炎癥反應(yīng)的調(diào)控。在LPS引起的急性肺部炎癥模型中，Muc1缺失小鼠表現(xiàn)出更嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，

6、Muc1起了抑制過度炎癥反應(yīng)的作用。但Muc1在哮喘發(fā)生中是否起了變化，以及Muc1在哮喘發(fā)生過程中是否有調(diào)控作用，都尚未有報道。
　　哮喘動物模型是研究哮喘發(fā)生的重要工具。目前應(yīng)用最廣泛的是小鼠哮喘動物模型。雖然哮喘動物模型目前很難完全模擬人類哮喘的全部特點，但某些哮喘的基本特征例如氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、氣道粘液高分泌和氣道重塑等都能在小鼠哮喘模型中模擬出來。成功的哮喘動物模型至少應(yīng)具備氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性的兩個基本特征。<

7、br>　　研究目的:
　　通過在BMP4和Muc1基因敲除小鼠上建立哮喘模型，觀察BMP4和Muc1蛋白在在哮喘疾病過程中的的變化情況，試圖闡明這兩種蛋白對哮喘發(fā)生的影響及其潛在機制。本研究將對尋找哮喘治療新的作用靶點具有積極意義。
　　研究方法:
　　基因鑒定：①、切取部分小鼠尾尖組織，加入裂解液后55℃過夜，以充分裂解小鼠尾巴組織；②、將小鼠尾巴組織裂解液中的DNA提純；③、以已經(jīng)提純的小鼠尾巴組織DNA為模板，進(jìn)

8、行PCR反應(yīng)；④、PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖膠電泳后成像。
　　運用不同劑量卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏和激發(fā)小鼠，建立小鼠哮喘模型：①、哮喘動物模型的建立。建模過程分為3個基本階段：腹腔注射佐劑+致敏原的致敏階段，1到2周的等待階段，最后4天連續(xù)致敏原滴鼻的激發(fā)階段。等待時間會根據(jù)造模小鼠不同遺傳背景而做調(diào)整。②、小鼠肺功能測定及實驗標(biāo)本的收集。造模結(jié)束后，用無創(chuàng)體描儀（plethysmography）法測定小鼠肺功能。隨

9、后處死小鼠，收集支氣管肺泡灌洗液、血清、肺組織等標(biāo)本。
　　評估肺組織炎癥反應(yīng)程度：①、統(tǒng)計支氣管肺泡灌洗液中分類細(xì)胞數(shù)及計算其所占比例。②、使用實時定量RT-PCR方法，檢測肺組織及支氣管肺泡灌洗液總細(xì)胞中以下細(xì)胞因子的mRNA水平：IL4、IL5、IL17A、IL1β、MCPT-8和CCL-11。③、肺石蠟切片H&E染色觀察肺組織炎癥反應(yīng)情況，過碘酸-雪夫染色（PAS染色）觀察氣道上皮杯狀細(xì)胞增生及粘液分泌情況。
　　哮

10、喘小鼠模型BMP4及Muc1表達(dá)水平檢測：①、使用Elisa法，檢測血清及支氣管肺泡灌洗液中BMP4成熟體蛋白的水平。使用蛋白免疫印跡方法，檢測肺組織中BMP4蛋白的表達(dá)水平。②、使用實時定量RT-PCR方法，檢測肺組織中BMP4和Muc1的表達(dá)水平。
　　實驗結(jié)果:
　　1.哮喘發(fā)生時BMP4蛋白的變化情況及功能。
　　1.1 哮喘發(fā)生后，肺組織中BMP4蛋白表達(dá)保持穩(wěn)定，但支氣管肺泡灌洗液中分泌型BMP4增加。其分

11、泌增加與激發(fā)致敏原劑量相關(guān)。
　　1.2 低劑量致敏原激發(fā)的哮喘模型小鼠中，BMP4+/+和BMP4+/-兩種小鼠在炎癥反應(yīng)的表型上沒有區(qū)別。
　　BMP4+/+和BMP4+/-兩種小鼠均出現(xiàn)支氣管肺泡灌洗液中細(xì)胞增多，肺組織炎癥細(xì)胞浸潤等炎癥癥狀，其中主要細(xì)胞類型為巨噬細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，另外還有少量嗜中性粒細(xì)胞。肺組織Th2和Th17細(xì)胞因子水平上調(diào)，但Th1細(xì)胞因子水平變化不明顯，且在BMP4+/+和BMP4+/-小鼠

12、之間沒有顯著性差異。
　　1.3 僅高劑量致敏原激發(fā)處理即可引起B(yǎng)ALF中嗜中性粒細(xì)胞增加。在腹腔致敏結(jié)合高劑量激發(fā)引起的哮喘小鼠模型中，與BMP4+/-小鼠相比，BMP4+/+小鼠BAL fluid中出現(xiàn)更嚴(yán)重的巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞增多現(xiàn)象，其肺組織Th1細(xì)胞因子IL1β水平更高，同時Th2細(xì)胞因子IL4水平相對下調(diào)。肺組織Th17細(xì)胞因子水平顯著上調(diào)但在兩種小鼠間沒有顯著性差異。與低劑量致敏原激發(fā)的哮喘相比，高

13、劑量致敏原激發(fā)的哮喘出現(xiàn)明顯的中性粒細(xì)胞增多現(xiàn)象，其中BAL fluid嗜中性粒細(xì)胞總數(shù)在兩種小鼠之間的差異比低劑量時更為明顯。檢查BAL fluid總細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)BMP4+/+小鼠 IL1β水平比BMP4+/-小鼠高，而IL4、IL17A和CCL11水平低于BMP4+/-小鼠。
　　1.4 嗜堿性細(xì)胞標(biāo)志物MCPT-8在該方法引起的哮喘發(fā)生前后沒有明顯變化。
　　2.哮喘發(fā)生時Muc1蛋白的變化情況及功能

14、。
　　2.1 哮喘發(fā)生時，肺組織Muc1水平下調(diào)。
　　2.2 Muc5ac在哮喘發(fā)生時上調(diào)，Muc1缺失不影響Muc5ac的上調(diào)。
　　2.3 接受腹腔致敏的小鼠，肺組織Th1細(xì)胞因子IL1β水平下調(diào)。僅腹腔致敏不能引起肺部炎癥。
　　2.4 僅致敏原激發(fā)處理不能引起肺部炎癥癥狀。
　　2.5 哮喘模型組中，與Muc1-/-小鼠相比，Muc1+/+小鼠出現(xiàn)更嚴(yán)重哮喘癥狀，包括：①、支氣管肺泡灌洗液中總細(xì)

15、胞數(shù)增加，增加的細(xì)胞絕大部分是嗜酸性粒細(xì)胞。②、肺組織出現(xiàn)更嚴(yán)重炎癥細(xì)胞侵潤、氣道上皮杯狀細(xì)胞增生和粘液分泌增高。③、肺組織Th2細(xì)胞因子IL5和Th17IL細(xì)胞因子17A、嗜酸性細(xì)胞趨化因子CCL11水平更高。而Th1細(xì)胞因子IL1β則呈現(xiàn)下調(diào)。
　　實驗結(jié)論:
　　1.哮喘發(fā)生時BMP4分泌增加，并且與激發(fā)哮喘的致敏原劑量相關(guān)。
　　2.低劑量致敏原激發(fā)的哮喘中，BMP4+/+和BMP4+/-小鼠之間在肺部炎癥反應(yīng)

16、上沒有顯著性差異。高劑量致敏原激發(fā)的哮喘中，與BMP4+/-小鼠比較，BMP4+/+小鼠出現(xiàn)更強的肺部炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為更顯著的炎性細(xì)胞浸潤。與低劑量激發(fā)哮喘組相比，高劑量致敏原在 BMP4+/+小鼠中引起明顯的嗜中性粒細(xì)胞增多。提示BMP4蛋白可能在哮喘發(fā)病中起調(diào)控炎癥反應(yīng)的作用，尤其可能影響多見于重癥哮喘的嗜中性粒細(xì)胞增多。
　　3.由于哮喘發(fā)生時肺組織Muc1表達(dá)下調(diào)，而Muc1完全缺失的小鼠哮喘癥狀卻更輕，那么Muc1的存在