鵝骨膠原蛋白及膠原多肽對骨質(zhì)疏松的影響及作用機(jī)制.pdf

1、骨質(zhì)疏松(Osteoporosis，OP)作為目前患病率非常高的一種疾病，常見于中老年人。骨質(zhì)疏松在世界性多發(fā)病位于前十名，全球 OP患者已經(jīng)超過2億人，我國的患病人口預(yù)計(jì)也將于21世紀(jì)中葉超過2億人。OP給人類的健康帶來嚴(yán)重威脅，同時也加重了人們的經(jīng)濟(jì)和思想負(fù)擔(dān)。OP的防治是全人類的課題，特別是預(yù)防，是當(dāng)下一個重要的研究方向。
　　我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達(dá)，鵝骨通常被粗加工成骨粉、骨糊等，資源得不到合理高值的利用，有些甚至直接被丟掉，

2、造成了經(jīng)濟(jì)損失。膠原蛋白和膠原多肽的研究較深入，生理功能非常豐富，對骨質(zhì)疏松有一定的防治作用，但至今還沒有有關(guān)鵝骨膠原蛋白及肽對骨質(zhì)疏松作用的研究報(bào)道。
　　本實(shí)驗(yàn)從鵝骨中提取膠原蛋白和膠原多肽，并用其培養(yǎng) SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，檢測其向成骨細(xì)胞(Osteoblast，OB)分化的程度，利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)探討了鵝骨膠原蛋白及膠原多肽

3、抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理。
　　一、對鵝骨進(jìn)行預(yù)處理，然后分別用胃蛋白酶和胰蛋白酶在不同的條件下提取鵝骨大分子膠原蛋白和小分子膠原多肽，分別用紫外光譜、傅里葉紅外光譜、熱穩(wěn)定性和十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對提取的膠原蛋白和多肽進(jìn)行了測定。結(jié)果證實(shí)所提取的膠原蛋白和肽純度較高，膠原蛋白為典型的I型膠原蛋白，結(jié)構(gòu)完整，分子量較大，肽分子量在30kDa以下。
　　二、通過研究鵝骨大分子膠原蛋白、含鈣大分子膠

4、原蛋白、小分子膠原多肽、含鈣小分子膠原多肽對大鼠 BMSCs增殖及向成骨分化的影響，闡述了鵝骨膠原蛋白和膠原多肽對骨質(zhì)疏松的作用機(jī)理。采用 MTT(噻唑藍(lán))法測定鵝骨膠原蛋白及膠原多肽對 BMSCs增殖的影響；堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)染色、ALP活性檢測、茜素紅染色檢測分析 BMSCs成骨分化能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和對照組比較，試驗(yàn)組可促進(jìn) BMSCs的增殖，第14d ALP染色試驗(yàn)組ALP染色陽性率顯著

5、高于對照組(p<0.05)，第7d和第14d鵝骨膠原蛋白及肽可顯著提高 ALP的活性表達(dá)(p<0.05)，第21d茜素紅染色發(fā)現(xiàn)：試驗(yàn)組鈣結(jié)節(jié)個數(shù)與對照組的相比較顯著增加(p<0.05)。由此表明，大分子膠原蛋白、含鈣大分子膠原蛋白、小分子膠原多肽、含鈣小分子膠原多肽均可促進(jìn) BMSCs的增殖及向成骨細(xì)胞分化，以含鈣小分子膠原多肽作用效果最佳。
　　三、分別在第3、6、9、12、14d通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定細(xì)胞培養(yǎng)

6、上清液中骨鈣素/骨鈣蛋白(Osteocalcin，OCN)、骨形成蛋白-2(Bone morphogenetic protein2，BMP-2)、I型膠原蛋白(Type I collage，Col I)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor2，Runx2)五種成骨分化相關(guān)因子的分泌量，發(fā)現(xiàn)骨鈣素、骨形成蛋白-2、I型膠原蛋白、骨橋蛋白、Ru

7、nt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2分泌量試驗(yàn)組顯著高于對照組(p<0.05)，并且以含鈣小分子膠原多肽促進(jìn)分泌作用最佳。
　　四、對培養(yǎng)到第14d的細(xì)胞進(jìn)行 RNA提取，再反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，然后通過RT-PCR技術(shù)，檢測成骨分化相關(guān)基因 BMP-2、OSX、Runx2及 TGF-β1基因表達(dá)水平的變化，分別使 BMP-2基因的表達(dá)水平上調(diào)了1.6599倍、1.9600倍、2.9432倍、4.2588倍，OSX基因表達(dá)上調(diào)了2.2503倍、2.1