晚期糖基化終產(chǎn)物修飾蛋白質(zhì)誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生C反應(yīng)蛋白及其作用機(jī)制研究.pdf

1、研究背景 心血管疾病(CardiovascularDiseases,CVD)是慢性腎臟疾病(ChronicKidneyDisease,CKD)患者死亡的主要原因。CKD患者動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率較正?；驘o(wú)慢性腎臟疾病的人群高10～20倍，且發(fā)病年齡明顯提前，被稱之為“加速性動(dòng)脈粥樣硬化”。C-反應(yīng)蛋白(C-ReactiveProtein，CRP)近10余年來(lái)的研究熱點(diǎn)。CKD時(shí)的微炎癥反應(yīng)是較為復(fù)雜的病理生理過(guò)程，不僅有包括IL-

2、6在內(nèi)的多種促炎癥細(xì)胞因子血癥，而且循環(huán)和組織中存在著各種因腎功能障礙而潴留的代謝產(chǎn)物或毒素，某些尿毒癥毒素已被證實(shí)具有較強(qiáng)的促炎癥活性，其中晚期糖基化終產(chǎn)物(AdvancedGlycationEndProducts,AGEs)修飾的蛋白質(zhì)是近年研究較為透徹的與炎癥反應(yīng)有關(guān)的一類(lèi)新型尿毒癥毒素。 AGEs是糖的醛基和蛋白質(zhì)的氨基之間非酶性糖化、氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物。我們課題組及國(guó)外學(xué)者的研究結(jié)果均表明，AGEs修飾蛋白具有顯著的促發(fā)

3、細(xì)胞炎癥反應(yīng)的功能，并參與微炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。且AGEs及其受體RAGE(ReceptorforAdvancedGlycationEndProducts)軸的活化水平與CKD患者血循環(huán)中CRP水平存在密切的正相關(guān)關(guān)系。然而，目前還不清楚AGEs修飾蛋白能否直接刺激肝細(xì)胞生成CRP，抑或通過(guò)誘導(dǎo)單核細(xì)胞生成促炎癥細(xì)胞因子間接上調(diào)CRP的生成。 研究方法 我們以AGEs修飾的人血清白蛋白(AGEs-HSA)作為AGEs模

4、型，以體外培養(yǎng)的人胚胎肝細(xì)胞(HumanFetalHepatocytes,HFHs)作為靶細(xì)胞，研究了AGEs對(duì)人胚胎肝細(xì)胞CRP的誘導(dǎo)作用及其作用機(jī)制 一人胚胎肝細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定 選用臨床上正常孕婦自然流產(chǎn)廢棄的孕期為20w-24w的胚胎肝臟標(biāo)本，應(yīng)用改良的Seglen's肝臟CollagenaseⅣ兩步灌流法分離人胚胎肝細(xì)胞。用DiscontinuousPercollGradients密度梯度離心法將胚胎

5、肝細(xì)胞純化，用Ham'sF12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)純化的人胚胎肝細(xì)胞。 二ELISA(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)法檢測(cè)胚胎肝細(xì)胞上清中CRP的濃度 1、AGEs-HSA對(duì)人胚胎肝細(xì)胞合成CRP的影響 人胚胎肝細(xì)胞接種于48孔板，然后給予AGEs-HSA(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)作用48h，收集上清，用ELISA法檢測(cè)其

6、中的CRP水平。 2、AGEs-HSA處理的單核細(xì)胞條件上清對(duì)人胚胎肝細(xì)胞合成CRP的影響 通過(guò)對(duì)不同劑量的AGEs-HSA處理人單核細(xì)胞不同時(shí)間的條件上清按不同摻入比例加入胚胎肝細(xì)胞培養(yǎng)體系作用48h進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，初步的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：100μg/mLAGEs-HSA處理48h的單核細(xì)胞條件上清在80％的摻入比例作用胚胎肝細(xì)胞48h時(shí)達(dá)到最大的時(shí)間劑量效應(yīng)。因此，我們選用100μg/mLAGEs-HSA處理48h的單核細(xì)

7、胞條件上清占胚胎肝細(xì)胞培養(yǎng)體系80％的濃度(簡(jiǎn)稱為：?jiǎn)魏思?xì)胞條件上清)作為下一步實(shí)驗(yàn)的刺激母液。同時(shí)，用100μg/mLHSA處理48h的單核細(xì)胞條件上清或單純RPMI1640處理48h的單核細(xì)胞條 3、細(xì)胞因子中和性抗體及其可溶性受體對(duì)單核細(xì)胞條件上清誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞合成CRP的影響 單核細(xì)胞條件上清母液分別與抗Interleukin(IL)-6(5μg/mL)、抗IL-1β(5μg/mL)、重組的人白介素1可溶性受體

8、Ⅰ(rhIL-1sRI)(10μg/mL)、抗TumorNerosisFactor(TNF)-α(10μg/mL)、重組的人腫瘤壞死因子可溶性受體Ⅰ(rhTNF-sRI)(200ng/mL)，或上述不同中和性抗體的疊加組合{抗IL-6(5μg/mL)+抗IL-1β(5μg/mL)、抗IL-6(5μg/mL)+抗IL-1β(5μg/mL)+抗TNF-α(10μg/mL)}預(yù)先孵育1h，然后再加入胚胎肝細(xì)胞培養(yǎng)體系，作用48h，收集細(xì)胞上清

9、，用ELISA法檢測(cè)其中的CRP水平。 4、單核細(xì)胞條件上清與外源性細(xì)胞因子對(duì)人胚胎肝細(xì)胞CRP誘導(dǎo)作用的比較 通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ELISA法檢測(cè)100μg/mLAGEs-HSA處理48h的單核細(xì)胞上清中的IL-6、IL-1β和TNF-α濃度分別為：12.124±0.134ng/mL，3.972±0.077ng/mL和13.052±0.165ng/mL。因此，上述單核細(xì)胞條件上清母液中IL-6、IL-1β和TNF-α的

10、濃度分別為：9.70ng/mL、3.18ng/mL和10.44ng/mL。 三、實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(RealTimeFluorescenceQuantitativeRT-PCR)檢測(cè)AGEs-HSA處理的單核細(xì)胞條件上清誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞CRPmRNA的表達(dá)水平 人胚胎肝細(xì)胞接種于60mm培養(yǎng)皿，分別給予上述單核細(xì)胞條件上清母液，1∶2、1∶4和1∶8倍比稀釋的單核細(xì)胞條件上清(用HamsF12條件培養(yǎng)基將上述單核細(xì)

11、胞條件上清作2倍，4倍和8倍稀釋而成)與人胚胎肝細(xì)胞共同培養(yǎng)48h。提取細(xì)胞總RNA，用SYBR(R)ExScripTMRT-PCRKit檢測(cè)其CRPmRNA水平。 結(jié)果 一、人胚胎肝細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定 1、運(yùn)用改良法分離人胚胎肝細(xì)胞活力＞99％；純化后可見(jiàn)淡黃色的胚胎肝細(xì)胞主要分布在1.057g/ml和1.063g/ml兩個(gè)密度條帶；Ham'sF12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的人胚胎肝細(xì)胞呈現(xiàn)典型的肝細(xì)胞特異性的

12、多角形形態(tài)。 2、所培養(yǎng)的細(xì)胞中無(wú)CD68陽(yáng)性細(xì)胞。用兔抗人VWF檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原VWF的表達(dá)，結(jié)果表明：所培養(yǎng)的細(xì)胞中無(wú)VWF陽(yáng)性細(xì)胞。用鼠抗人Desmin檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)體系中肝儲(chǔ)脂細(xì)胞特異性抗原Desmin的表達(dá)，結(jié)果表明：所培養(yǎng)的細(xì)胞中無(wú)Desmin染色陽(yáng)性細(xì)胞。 3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)離心純化后不同密度的Percoll條帶中肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和肝Kuffer's細(xì)胞的比例，結(jié)果表明：胚胎肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞主要聚

13、集在1.057g/mL和1.063g/mL兩個(gè)密度條帶，其中的胚胎肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞比例分別為72.70±0.63％，77.60±3.34％，而肝Kuffer's細(xì)胞主要聚集在1.052g/mL密度條帶，含量為12.92±1.13％。 二、AGEs-HSA對(duì)人胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP的誘導(dǎo)作用 結(jié)果表明：不同劑量的AGEs-HSA處理組之間以及與陰性對(duì)照組之間相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 三、單核細(xì)胞條件上清對(duì)人胚胎肝

14、細(xì)胞產(chǎn)生CRP的誘導(dǎo)作用 1、單核細(xì)胞條件上清以時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞合成CRP。48h時(shí)達(dá)到最大時(shí)間效應(yīng)，與12h及24h相比有顯著性差異(P＜0.001)。 2、1∶2倍比稀釋的單核細(xì)胞條件上清與胚胎肝細(xì)胞孵育48h即可顯著誘導(dǎo)胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，且單核細(xì)胞條件上清以劑量依賴的方式誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP。 四、細(xì)胞因子中和性抗體及其可溶性受體對(duì)單核細(xì)

15、胞條件上清誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP的中和作用表明：抗IL-6、抗IL-1β及IL-1sRI均可部分抑制單核細(xì)胞條件上清對(duì)人胚胎肝細(xì)胞CRP合成的誘導(dǎo)作用，與未加細(xì)胞因子中和性抗體的單核細(xì)胞條件上清處理組相比有顯著性差異(P＜0.01)；抗IL-6能夠更顯著地抑制單核細(xì)胞條件上清對(duì)人胚胎肝細(xì)胞CRP合成的誘導(dǎo)作用，與抗IL-1β及IL-1sRI處理組相比有顯著性差異(P＜0.01)；抗IL-1β及IL-1sRI可以同等程度地抑制單核細(xì)胞

16、條件上清對(duì)人胚胎肝細(xì)胞CRP合成的誘導(dǎo)作用，二者相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 五、單核細(xì)胞條件上清與外源性細(xì)胞因子對(duì)人胚胎肝細(xì)胞CRP誘導(dǎo)作用的比較對(duì)外源性細(xì)胞因子的研究結(jié)果表明：3.18ng/mLIL-1β和9.7ng/mLIL-6處理組均可顯著誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)，但二者對(duì)CRP的誘導(dǎo)作用均明顯低于單核細(xì)胞條件上清對(duì)CRP的誘導(dǎo)作用(P＜0.05)。 所有細(xì)胞因

17、子組合均可顯著誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞產(chǎn)生CRP，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 六、1∶2倍比稀釋的單核細(xì)胞條件上清即可顯著誘導(dǎo)CRPmRNA表達(dá)，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。單核細(xì)胞條件上清呈現(xiàn)以劑量依賴方式誘導(dǎo)人胚胎肝細(xì)胞CRPmRNA的表達(dá)，在與單核細(xì)胞條件上清母液作用時(shí)達(dá)到最大劑量效應(yīng)，與1∶2倍比稀釋的單核細(xì)胞條件上清處理組相比有顯著性差異(P＜0.01)。 結(jié)論 1應(yīng)用我們