二氫楊梅素和楊梅素對急性低氧條件下運(yùn)動能力的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究.pdf

1、人體快速進(jìn)入高原時，低壓低氧是導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動能力下降的主要原因。這時預(yù)先進(jìn)行階梯習(xí)服是最好的預(yù)防措施，然而未來軍事斗爭需要部隊(duì)快速進(jìn)駐高原并迅速投入戰(zhàn)斗，因此上述習(xí)服方式在戰(zhàn)時的意義不大，需要針對急進(jìn)高原部隊(duì)進(jìn)行合理的外源性藥物或營養(yǎng)補(bǔ)充劑的干預(yù)，據(jù)報道目前可預(yù)防高原反應(yīng)的藥物多數(shù)具有副作用，因此尋找副作用小，能夠預(yù)防高原反應(yīng)并增強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動耐力的藥物或營養(yǎng)補(bǔ)充劑顯得尤為重要，相關(guān)研究目前已成為運(yùn)動醫(yī)學(xué)，軍事醫(yī)學(xué)和營養(yǎng)學(xué)跨學(xué)科交叉的熱點(diǎn)。<

2、br>　　回顧文獻(xiàn)并根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多酚活性化合物因具備良好的抗氧化、清除自由基等多種生物學(xué)活性，其應(yīng)用前景日益受到重視，且多項(xiàng)研究證實(shí)其中的代表物槲皮素可以增強(qiáng)機(jī)體有氧運(yùn)動能力和骨骼肌線粒體生物合成。因此本研究提出科學(xué)假設(shè):急性低壓低氧條件下機(jī)體產(chǎn)生的運(yùn)動不耐受，主要機(jī)理可能是因線粒體功能紊亂并導(dǎo)致的骨骼肌損傷，而多酚活性化合物可能通過作用于骨骼肌線粒體而對急性低壓低氧條件下機(jī)體的運(yùn)動耐力具有保護(hù)效應(yīng)。
　　研究目的:

3、1.通過低壓氧艙建立急性低壓低氧大鼠跑步力竭運(yùn)動損傷模型，明確多酚活性植物化合物對急性低壓低氧大鼠運(yùn)動耐力的保護(hù)作用，并篩選出有效的化合物;
　　2.闡明急性低壓低氧環(huán)境下骨骼肌線粒體代謝紊亂與運(yùn)動耐力下降之間的關(guān)系，揭示多酚活性化合物產(chǎn)生運(yùn)動保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　研究方法:第一部分:常見多酚活性化合物對急性低壓低氧條件下大鼠運(yùn)動能力的影響
　　1.實(shí)驗(yàn)大鼠分組給藥:即平原常氧對照組，低壓低氧對照組，紅景天陽性對照

4、組，槲皮素干預(yù)組，楊梅素干預(yù)組，二氫楊梅素干預(yù)組，白藜蘆醇干預(yù)組。每種藥物組再根據(jù)設(shè)定的給藥劑量分為50mg/kg.bw/d、75 mg/kg.bw/d、100mg/kg.bw/d、150mg/kg.bw/d、200mg/kg.bw/d組，預(yù)先連續(xù)灌胃7天，每天1次。
　　2.利用低壓氧艙模擬高原急性低壓低氧條件，并在轉(zhuǎn)輪式跑步機(jī)上完成大鼠跑步力竭實(shí)驗(yàn)來評價大鼠的運(yùn)動能力，并觀察楊梅素，二氫楊梅素，槲皮素和白藜蘆醇等四種常見多酚活

5、性化合物預(yù)防性干預(yù)后對急性低壓低氧條件下大鼠力竭時間的影響;
　　3.跑步力竭實(shí)驗(yàn)后收集大鼠血清，利用全自動生化分析儀檢測血清中常規(guī)代謝指標(biāo)尿素氮（BUN）、肌酸激酶(CK)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平;
　　4.收集大鼠腓腸肌標(biāo)本，利用透射電鏡觀察各組大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化。
　　第二部分:二氫楊梅素對骨骼肌微損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　第一節(jié)二氫楊梅素通過防止線粒體代謝紊亂來保護(hù)骨骼肌微損傷
　

6、　1.二氫楊梅素選取三個劑量組以及力竭實(shí)驗(yàn)對照組大鼠標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠骨骼肌細(xì)胞呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ的活性;
　　2.提取大鼠腓腸肌組織線粒體DNA，采用實(shí)時定量PCR檢測線粒體DNA的表達(dá);
　　3.采用Western blot方法檢測大鼠腓腸肌組織線粒體分裂融合相關(guān)蛋白表達(dá)。
　　第二節(jié)SIRT3基因在二氫楊梅素保護(hù)骨骼肌微損傷效應(yīng)中的作用和機(jī)制
　　1.實(shí)驗(yàn)小鼠分組及給藥

7、方案:野生小鼠隨機(jī)分為野生小鼠靜止對照組、野生小鼠運(yùn)動對照組和野生小鼠DHM運(yùn)動實(shí)驗(yàn)組;SIRT3基因敲除小鼠隨機(jī)分為基因敲除小鼠運(yùn)動對照組和基因敲除小鼠DHM運(yùn)動實(shí)驗(yàn)組，DHM取劑量統(tǒng)一為100 mg/kg.bw/d，預(yù)先連續(xù)給藥，共持續(xù)4周;
　　2.建立小鼠轉(zhuǎn)輪跑步骨骼肌微損傷模型，除靜止對照組外，其余四組均連續(xù)進(jìn)行4周的轉(zhuǎn)輪跑步疲勞性運(yùn)動，完成后次日進(jìn)行一次跑步力竭實(shí)驗(yàn)，24小時后處死并收集小鼠血清和腓腸肌標(biāo)本;
　

8、　3.采用試劑盒檢測小鼠血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)和總超氧化物歧化酶(T-SOD)的水平，以及骨骼肌組織中丙二醛(MDA)含量;
　　4.利用透射電鏡觀察小鼠腓腸肌超微結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化;
　　5.采用Western blot方法檢測小鼠腓腸肌組織SIRT3及線粒體功能調(diào)節(jié)蛋白表達(dá);
　　6.利用免疫共沉淀檢測小鼠腓腸肌組織SIRT3-OPA1蛋白表達(dá);
　　7.利用免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠腓腸肌SI

9、RT3及線粒體功能調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)。 研究結(jié)果:一、多酚活性化合物槲皮素、楊梅素和二氫楊梅素在急性低壓低氧環(huán)境下對大鼠運(yùn)動能力有明顯的保護(hù)作用。
　　1.急性低壓低氧環(huán)境下大鼠的跑步力竭時間大幅縮短，明顯低于平原常氧對照組大鼠;
　　2.四種常見多酚活性化合物中，除白藜蘆醇外，槲皮素、楊梅素和二氫楊梅素預(yù)先干預(yù)后大鼠的力竭時間與低壓低氧對照組大鼠相比明顯延長，但劑量-效應(yīng)曲線有所不同，楊梅素和二氫楊梅素的效用比較突出

10、且類似，在75mg/kg.bw/d劑量組即可產(chǎn)生明顯的效應(yīng)，而槲皮素需劑量達(dá)150mg/kg.bw/d時才能發(fā)揮作用，且效果不及楊梅素和二氫楊梅素;
　　3.急性低壓低氧條件下大鼠運(yùn)動力竭后，其血清BUN、LDH和CK三個代謝指標(biāo)水平均顯著升高;
　　4.四種常見多酚活性化合物中只有楊梅素和二氫楊梅素對BUN的影響顯著，二者實(shí)驗(yàn)組大鼠與高原低氧對照組相比血清BUN值明顯下降，而槲皮素和白藜蘆醇對BUN的作用甚微，即便是最高劑

11、量組200mg/kg.bw/d，血清BUN值也只是略有下降，統(tǒng)計(jì)學(xué)無顯著差異;
　　5.四種常見多酚活性化合物中只有白藜蘆醇對LDH的作用不明顯，其余均可降低大鼠在急性低壓低氧條件下跑步力竭后血清LDH值，三者的劑量-效應(yīng)曲線區(qū)別較大，其中楊梅素的作用最強(qiáng);
　　6.四種常見多酚活性化合物中只有白藜蘆醇對血清CK的作用不大，其余三種均可不同程度的降低大鼠在急性低壓低氧暴露下力竭后血清CK水平，其中二氫楊梅素的作用最明顯;

12、r>　　7.急性低壓低氧條件下大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為不規(guī)則的肌原纖維，Z線模糊且出現(xiàn)散亂，肌質(zhì)網(wǎng)開始溶解，而二氫楊梅素干預(yù)可顯著減輕上述損傷，但其余幾種化合物干預(yù)后改善不明顯。
　　二、二氫楊梅素在急性低壓低氧環(huán)境下能有效減輕大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷，維持骨骼肌線粒體代謝動力學(xué)并保護(hù)線粒體增殖以及呼吸鏈活性。
　　1.在急性低壓低氧環(huán)境下大鼠骨骼肌的四種線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性均受到明顯的抑制和損傷，當(dāng)二氫楊梅素干預(yù)劑量達(dá)到

13、100mg/kg.bw/d時能夠有效的保護(hù)酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性，但對酶復(fù)合體Ⅴ的作用并不明顯;
　　2.急性低壓低氧環(huán)境下大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體DNA的相對含量急劇降低，而二氫楊梅素干預(yù)后，線粒體DNA的相對含量有顯著提升，并且呈現(xiàn)出劑量依賴性;
　　3.急性低壓低氧環(huán)境對大鼠骨骼肌線粒體分裂融合相關(guān)的四種調(diào)控蛋白的表達(dá)影響很大，其中MFN1和MFN2下降明顯，DRP1和FIS1則顯著上升，而通過二氫楊梅素干預(yù)后上述融合蛋

14、白和分裂蛋白的變化趨勢在100mg/kg.bw/d劑量組得到有效抑制。
　　三、SIRT3是二氫楊梅素保護(hù)骨骼肌微損傷效用中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子
　　1.二氫楊梅素對野生小鼠過度運(yùn)動導(dǎo)致的骨骼肌微損傷有明顯保護(hù)作用;
　　2.二氫楊梅素對SIRT3基因敲除小鼠過度運(yùn)動后骨骼肌微損傷無明顯保護(hù)作用;
　　3.二氫楊梅素對小鼠過度運(yùn)動導(dǎo)致的PGC-1α和ERRα表達(dá)下調(diào)有明顯的遏制作用，而且這種作用效果并不受SIRT3基因

15、敲除的影響;
　　4.免疫共沉淀的結(jié)果顯示SIRT3-OPA1相互作用密切，而Western blot實(shí)驗(yàn)檢測顯示疲勞性運(yùn)動導(dǎo)致線粒體代謝動力學(xué)向分解代謝發(fā)展，而二氫楊梅素干預(yù)后這種趨勢得到有效抑制，但這種作用對過度運(yùn)動的SIRT3基因敲除小鼠沒有效果。
　　四、楊梅素在常氧條件和急性低氧條件下均能促進(jìn)大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體生物合成，并可保護(hù)線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體活性和膜電位，從而糾正線粒體的功能紊亂。
　　1.急性低壓低

16、氧條件下大鼠骨骼肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)損傷明顯，而楊梅素干預(yù)能有效抵抗這種損傷，并呈現(xiàn)出劑量依賴性;
　　2.急性低壓低氧暴露并跑步力竭后，大鼠腓腸肌細(xì)胞的四種線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體的活性都顯著下降，預(yù)先服用楊梅素且劑量達(dá)到100mg/kg.bw/d時，酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ的活性有明顯上升;
　　3.急性低氧處理后L6骨骼肌細(xì)胞線粒體膜電位顯著下降，而楊梅素預(yù)處理后能夠在很大程度上阻止膜電位的下降趨勢;
　　研究結(jié)論:1、多酚類

17、活性化合物槲皮素、楊梅素和二氫楊梅素可以明顯減輕急性低壓低氧環(huán)境下機(jī)體運(yùn)動耐力的下降，其中二氫楊梅素和楊梅素的作用更為顯著，二者的效應(yīng)均表現(xiàn)出劑量依賴性，在100mg/kg.bw/d這一劑量水平即達(dá)到作用最大化。
　　2、二氫楊梅素在急性低壓低氧環(huán)境下能通過維持骨骼肌線粒體代謝動力學(xué)即分裂融合的平衡有效減輕大鼠骨骼肌超微結(jié)構(gòu)損傷，另外對骨骼肌線粒體呼吸鏈活性以及增殖都有保護(hù)效應(yīng)，這可能是其防止運(yùn)動耐力下降的重要原因。
　　綜