p85β在p110αE545K結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用機(jī)制及腫瘤標(biāo)志物分析方法的研究.pdf

1、目的：
　　癌癥仍然是困擾人類的世界性醫(yī)學(xué)問題，探討癌癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于認(rèn)清癌癥本質(zhì)、攻克癌癥難題具有非常重要的意義。同時(shí)，建立與腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物的檢測方法，能為癌癥的早期篩查提供重要的方法學(xué)基礎(chǔ)。因此，本論文的研究目的有以下幾個(gè)方面:(1)研究結(jié)直腸癌細(xì)胞IRS1和p110α E545K的特征及其對(duì)下游信號(hào)的影響，探究這兩種蛋白在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用;(2)研究PI3K調(diào)節(jié)亞基p85β，在含有p110α E54

2、5K突變的結(jié)直腸癌中可能存在的新的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制;(3)發(fā)掘發(fā)揮該生物學(xué)功能的關(guān)鍵基因信息，并探討其與p85β生物功能的相關(guān)性;(4)建立檢測與癌癥發(fā)生相關(guān)的DNA氧化性損傷生物標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）和腫瘤標(biāo)志物葉酸受體(FR1)的簡便準(zhǔn)確的分析方法，為癌癥的早期診斷和篩查提供方法學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.在人結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞和p110α只含有E545K突變型等位基因的DLD1細(xì)胞（以下簡稱D

3、LD1 Mut-only細(xì)胞）的基礎(chǔ)上，分別將IRS1基因敲除。利用蛋白印跡和表型分析的方法，比較敲除IRS1前后，細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化及細(xì)胞凋亡、平板集落和軟瓊脂集落形成的能力，探究IRS1對(duì)癌細(xì)胞的重要性。
　　2.在DLD1 Mut-only細(xì)胞的基礎(chǔ)上，構(gòu)建p110α D933A突變及p110α E545K基因敲除細(xì)胞系。利用蛋白印跡和表型分析的方法，比較突變及敲除p110α前后，細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)水平變化及細(xì)胞凋亡

4、、平板集落和軟瓊脂集落形成的能力，探究p110α對(duì)癌細(xì)胞的重要性。
　　3.在人結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞、只含有野生型p110α等位基因的DLD1細(xì)胞（以下簡稱DLD1 WT-only細(xì)胞）、DLD1 Mut-only細(xì)胞、HCT116細(xì)胞、RKO細(xì)胞以及SW480細(xì)胞中，利用免疫共沉淀的方法，探討p110α、IRS1、p85α及p85β的相互作用關(guān)系。
　　4.在DLD1 Mut-only細(xì)胞基礎(chǔ)上，將p85β基因敲除，構(gòu)建p

5、85β KO細(xì)胞系。通過表型分析（包括細(xì)胞凋亡、平板集落和軟瓊脂集落形成、裸鼠異種移植瘤模型）研究p85β基因敲除前后細(xì)胞表型的變化，從而確定p85β的生物學(xué)功能。在此基礎(chǔ)上，通過蛋白印跡技術(shù)研究與p85β生物學(xué)功能相關(guān)的分子機(jī)制。
　　5.在DLD1 WT-only細(xì)胞、DLD1 Mut-only細(xì)胞、HCT116 WT-only細(xì)胞(p110α只含有野生型等位基因的HCT116細(xì)胞)、HCT116 Mut-only細(xì)胞(p11

6、0α只含有H1047R突變型等位基因的HCT116細(xì)胞)中，利用免疫熒光染色及激光共聚焦技術(shù)，確定p85β的細(xì)胞定位情況。
　　6.利用“cNLS Mapper”預(yù)測p85β的關(guān)鍵核定位信息，在p85β KO細(xì)胞的基礎(chǔ)上，構(gòu)建HA標(biāo)記的野生型p85β及HA標(biāo)記的關(guān)鍵核定位信號(hào)突變的p85β過表達(dá)細(xì)胞系。通過免疫熒光染色及激光共聚焦技術(shù)，對(duì)預(yù)測得到的p85β的關(guān)鍵核定位信息進(jìn)行驗(yàn)證。
　　7.在DLD1基礎(chǔ)上，利用CRISPR

7、-Cas9技術(shù)構(gòu)建關(guān)鍵核定位信號(hào)突變的p85β基因敲入細(xì)胞系。通過裸鼠異種移植瘤模型，在人結(jié)直腸癌DLD1親代細(xì)胞上，驗(yàn)證與p85β致癌功能相關(guān)的關(guān)鍵基因信息。
　　8.利用抗原抗體的特異性反應(yīng)及免疫膠體金技術(shù)，通過吸光光度法建立與腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）的分析方法。
　　9.利用抗原抗體的特異性反應(yīng)及免疫膠體金技術(shù)，通過共振瑞利散射法建立腫瘤標(biāo)志物葉酸受體(FR)的檢測方法。
　　結(jié)果：<

8、br>　　在DLD1或DLD1 Mut-only細(xì)胞基礎(chǔ)上，將IRS1基因敲除后，p110α E545K的蛋白表達(dá)也隨之降低，而p85β的表達(dá)量不受影響。IRS1基因敲除后，下游pAKT表達(dá)量下降，而對(duì)MAPK信號(hào)通路無影響。敲除IRS1基因可以促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生自主性凋亡，抑制癌細(xì)胞的平板集落和軟瓊脂集落的形成能力，從而降低癌細(xì)胞的惡性程度。
　　p110αE545K基因突變及敲除后，IRS1和p85β的表達(dá)量均不會(huì)受到影響，下游p

9、AKT表達(dá)量下降，而對(duì)MAPK信號(hào)通路無影響。從表型分析結(jié)果看出，p110α E545K基因敲除也可以降低癌細(xì)胞的惡性程度。
　　在DLD1 WT-only和DLD1 Mut-only兩種癌細(xì)胞系中，p85α均結(jié)合在p110α上。在DLD1 WT-only癌細(xì)胞系中，p85β同時(shí)與p110α及IRS1相結(jié)合，發(fā)揮其調(diào)節(jié)亞基的作用。而在DLD1 Mut-only癌細(xì)胞系中，p85β從p110α E545K中解離下來，且解離下來的p8

10、5β也不再與IRS1發(fā)生相互結(jié)合。p85β從p110α解離下來的事實(shí)只特異于含有p110α E545K突變的細(xì)胞系，在其他人結(jié)直腸癌細(xì)胞中沒有該現(xiàn)象。
　　為研究p85β的生物學(xué)功能，我們?cè)诤衟110αE545K突變的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中構(gòu)建了p85β基因敲除細(xì)胞系。p85β基因敲除后，癌細(xì)胞的凋亡數(shù)增加、平板集落和軟瓊脂集落數(shù)下降、在裸鼠兩側(cè)接種的異種移植瘤的形成能力降低。這些結(jié)果表明游離的p85β在含有p110αE545K突變

11、的腫瘤細(xì)胞中也具有了一定的致癌活性。分子機(jī)制研究顯示，p85β的該項(xiàng)功能可能與JNK/c-jun信號(hào)通路有關(guān)。
　　通過免疫熒光染色對(duì)p85β進(jìn)行細(xì)胞定位時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有在含有p110α E545K突變的人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，解離下來的p85β進(jìn)入了細(xì)胞核，而在其他細(xì)胞中，p85β均位于胞漿。對(duì)p85β的關(guān)鍵核定位信息分析顯示，位于整個(gè)p85β氨基酸序列第477和478位的賴氨酸和精氨酸“KR”對(duì)p85β在p110α E545K突變型癌

12、細(xì)胞中入核的行為非常關(guān)鍵。將這兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸突變成“AA”（兩個(gè)丙氨酸），然后在p85β KO細(xì)胞基礎(chǔ)上分別過表達(dá)野生型p85β和突變型p85β，發(fā)現(xiàn)野生型p85β質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)后，p85β仍然入核;而突變型p85β質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)后，p85β則在胞漿。裸鼠異種移植瘤模型結(jié)果表明，在人結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞基礎(chǔ)上，將p85β基因的“KR”突變成“AA”后，癌細(xì)胞的成瘤能力明顯減弱。以上結(jié)果說明，“KR”序列確實(shí)是p85β的關(guān)鍵入核信號(hào)，且該信號(hào)對(duì)p85

13、β的致癌性能關(guān)系重大。
　　另一方面，對(duì)與腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物8-OHdG的檢測結(jié)果顯示，免疫膠體金吸收波長紅移的波長數(shù)和8-OHdG的濃度呈很好的線性關(guān)系，檢測范圍0.25-5.00μg/mL，最低檢出限25 ng/mL。且隨著8-OHdG的濃度的增大，膠體金的顏色從紅逐漸變紫甚至變藍(lán)，根據(jù)顏色的變化實(shí)現(xiàn)了8-OHdG的半定量可視化檢測。透射電鏡結(jié)果顯示，波長的移動(dòng)和顏色的變化與膠體金聚集狀態(tài)有關(guān)。
　　通過共振瑞利散射的

14、信號(hào)增強(qiáng)和濃度之間的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對(duì)葉酸受體FR1的簡單快速定量測定。線性范圍0.50-37.50 ng/mL，最低檢出限0.05 ng/mL。利用共振瑞利散射作為響應(yīng)信號(hào)，大大提高了檢測方法的靈敏度。
　　結(jié)論：
　　在結(jié)直腸癌分子機(jī)制的研究中，我們發(fā)現(xiàn)IRS1及p110α E545K對(duì)于DLD1癌細(xì)胞形成的腫瘤的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，二者通過AKT信號(hào)通路發(fā)揮致癌作用。在含有p110αE545K突變的人結(jié)直腸癌DLD1細(xì)胞中

15、，p85其中的一種亞型p85β從p110α E545K蛋白上特異性地解離下來，解離下來的p85β也不再與IRS1結(jié)合。游離的p85β特異性的進(jìn)入了含有p110α E545K突變的DLD1癌細(xì)胞的細(xì)胞核中。入核后的p85β本身也具有了一定的致癌活性，且p85β的入核行為及致癌活性與其序列中位于第477位和478位的“KR”具有重要相關(guān)性。在與腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物的分析方法方面，我們成功建立了兩種標(biāo)志物（8-OHdG和FR1）的檢測方法，該

16、方法具有快速方便，操作簡單，選擇性好等優(yōu)點(diǎn)。
　　本論文的創(chuàng)新性：
　　(1)發(fā)現(xiàn)了不與p110α結(jié)合的獨(dú)立的p85β的新的生物學(xué)功能，并揭示了發(fā)揮該新生物學(xué)功能的關(guān)鍵基因信息，為腫瘤藥物設(shè)計(jì)篩選和臨床治療提供一個(gè)極具前景的新靶點(diǎn)。
　　(2)建立了兩種與腫瘤相關(guān)的生物標(biāo)志物的簡單快速的分析檢測方法，為癌癥的早期診斷提供重要的方法學(xué)理論依據(jù)。
　　局限陛及未來計(jì)劃：
　　本文仍存在局限性，表現(xiàn)在:(1)對(duì)基

17、于DLD1構(gòu)建的p85β KR突變基因敲入細(xì)胞的表型分析不夠全面;(2)對(duì)可能影響p85β生物學(xué)功能的分子機(jī)制的研究不夠深入明晰;(3)實(shí)驗(yàn)建立的對(duì)8-OHdG的檢測方法的靈敏度有待進(jìn)一步提高。
　　針對(duì)以上不足，未來將對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行完善和優(yōu)化。(1)對(duì)p85β KR突變基因敲入細(xì)胞進(jìn)行多種表型分析，如細(xì)胞凋亡、集落形成及軟瓊脂等實(shí)驗(yàn);(2)查閱文獻(xiàn)，進(jìn)一步分析研究影響p85β生物學(xué)功能的下游信號(hào)通路，找到能合理解釋p85β致癌活性的