去甲斑蝥素對(duì)高濃度胎牛血清誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　研究去甲斑蝥素（NCTD）對(duì)體外培養(yǎng)的人腎小球系膜細(xì)胞（HMC）增殖和凋亡的影響，初步探討其機(jī)制，為NCTD應(yīng)用于慢性腎臟病的防治提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法：
　　1．MTT實(shí)驗(yàn)：通過檢測梯度濃度胎牛血清（FBS）對(duì)HMCs增殖的影響，確定促HMCs增殖效果最佳的時(shí)間及濃度；
　　2．Hoechest33258實(shí)驗(yàn)：通過觀察熒光顯微鏡下HMCs的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，探究NCTD作用不同時(shí)間對(duì)HMCs凋亡

2、的影響；
　　3．JC-1熒光探針染色實(shí)驗(yàn)：通過熒光顯微鏡與流式細(xì)胞術(shù)檢測NCTD作用12h后HMCs中 JC-1聚合物/JC-1單體的值，確定HMCs線粒體膜電位的變化；
　　4．ELISA實(shí)驗(yàn)：通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測NCTD作用12h后HMCs胞漿Cyt-C的表達(dá)，初步探討HMCs凋亡的通路。
　　結(jié)果：
　　1.MTT實(shí)驗(yàn)顯示FBS誘導(dǎo)HMCs增殖與濃度和時(shí)間相關(guān)，以25％FBS與30%FBS處理12h后細(xì)

3、胞活力較佳，其增值率分別為61.13±4.73）%及（68.10±9.15）%，與空白對(duì)照組相比差異有顯著性（P＜0.01），選擇25%FBS進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。NCTD對(duì)25%FBS誘導(dǎo)的HMCs的增殖呈抑制作用，其抑制率呈時(shí)間—?jiǎng)┝恳蕾囮P(guān)系（P＜0.05）。半數(shù)抑制濃度（IC50）隨著NCTD作用時(shí)間的延長逐漸降低，非線性擬合計(jì)算24h的IC50為10.03ug/ml，48h的IC50為7.58ug/ml；
　　2．Hoechest

4、33258實(shí)驗(yàn)顯示對(duì)照組及增殖組細(xì)胞核均質(zhì)、大小勻稱，NCTD干預(yù)后各實(shí)驗(yàn)組不同程度地核濃集,或邊集、呈碎片狀，出現(xiàn)凋亡小體。2.5ug/mlNCTD干預(yù)HMCs6h、12h、24h后凋亡率分別為（4.63±1.55）%，（5.22±2.27）%和（10.55±3.41）%，與對(duì)照組及增殖組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；5ug/mlNCTD干預(yù)HMCs6h、12h、24h后凋亡率分別為（15.61±4.67）%，（18.13±2.

5、78）%，（31.51±7.64）%，與對(duì)照組（1.49±0.47）%及增殖組（1.39±0.85）%比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；10ug/mlNCTD干預(yù)HMCs6h、12h、24h后凋亡率分別為（33.24±13.15）%、（45.53±6.24）%、（78.92±11.12）%，與對(duì)照組（5.48±3.24）%及增殖組（8.12±10.55）%比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明NCTD可誘導(dǎo)HMCs凋亡，其凋亡率具有

6、時(shí)間-劑量依賴的特點(diǎn)；
　　3.JC-1熒光探針染色實(shí)驗(yàn)顯示NCTD作用12h后，與對(duì)照組及增殖組相比，HMCs線粒體膜電位隨NCTD暴露濃度的升高顯著下降，流式細(xì)胞術(shù)檢測HMCs的線粒體膜電位改變結(jié)果示與對(duì)照組（1.71±0.25）相比，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞JC-1聚合物/JC-1單體的值呈濃度依賴性顯著降低（0.47±0.14、0.37±0.19、0.22±0.11、0.14±0.04），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，但各實(shí)驗(yàn)組組間

7、差異并不顯著(P＞0.05)；
　　4.Cyt-C ELISA酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)提示，與對(duì)照組及增殖組相比，NCTD作用于 HMCs12h后能顯著增加細(xì)胞色素 C的釋放量，2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml4個(gè)不同濃度的加藥組細(xì)胞色素C的濃度分別為(15.95±0.29,17.96±0.28，43.98±2.10,56.07±2.35)ng/ml，與增殖組（0.99±1.40）相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

8、＜0.05），與對(duì)照組（11.35±6.22）相比，2.5μg/ml、5μg/ml劑量的NCTD加藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，10μg/ml、20μg/ml劑量的NCTD加藥組組間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著（P＜0.05）。這提示了NCTD或通過破壞線粒體通透性，使細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞胞漿中，誘導(dǎo)了HMC細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.高濃度FBS誘導(dǎo)HMCs呈濃度-時(shí)間依賴性顯著增殖，以25%FBS干預(yù)12h為佳；
　　2.一定