超聲介導(dǎo)葉酸靶向攜氧載藥脂質(zhì)微泡對(duì)乏氧卵巢癌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡的制備及其基本性質(zhì)鑒定
　　目的:制備一種新型的葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡，檢測(cè)其基本特性。
　　方法:采用機(jī)械振蕩法制備葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡和普通脂質(zhì)微泡，觀察并比較兩種微泡的穩(wěn)定性，檢測(cè)其粒徑及粒度分布、電位、超聲介導(dǎo)釋氧能力、載藥量、包封率及葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡表面葉酸連接情況。
　　結(jié)果:葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡與普通脂質(zhì)微泡基本特性大體一致。微泡的穩(wěn)定

2、性隨著時(shí)間及溫度變化而改變，兩種微泡4℃可穩(wěn)定存在兩周，兩周后微泡出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，而37℃兩種微泡僅能穩(wěn)定存在2h，2h后微泡粒徑變大,但無(wú)聚集現(xiàn)象。葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡平均粒徑為（1.81±0.04）μm, Zeta電位分別為-(11.75±1.56)mv，載藥量為（24.60±1.23）％，包封率為(86.10±3.47）%，而普通脂質(zhì)微泡平均粒徑為（1.78±0.05）μm, Zeta電位為-(14.93±0.50)mv，載

3、藥量為（26.72±2.31）%，包封率為（93.51±4.74）%。超聲輻照能增加缺氧環(huán)境中微泡內(nèi)氧氣的釋放。制備的葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡葉酸配體免疫熒光試驗(yàn)陽(yáng)性，與 FITC標(biāo)記的葉酸抗體結(jié)合率高達(dá)(96.29±0.67)%，明顯高于FITC標(biāo)記的葉酸抗體與普通脂質(zhì)微泡結(jié)合率（3.89±1.64）%（p<0.05）。
　　結(jié)論:成功制備了葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡，有望成為一種新型可用于超聲控釋的靶向藥物載體。

4、　　第二部分葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞及巨噬細(xì)胞體外尋靶能力的鑒定
　　目的:鑒定卵巢癌SKOV3細(xì)胞及巨噬細(xì)胞葉酸受體的表達(dá)情況，并觀察TOPLMBs對(duì)這兩種細(xì)胞體外尋靶能力。
　　方法:體外培養(yǎng)卵巢癌SKOV3細(xì)胞及巰基乙酸鹽誘導(dǎo)法獲取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。免疫熒光法檢測(cè)兩種細(xì)胞葉酸受體的表達(dá)情況。觀察葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡對(duì)卵巢癌 SKOV3細(xì)胞及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞結(jié)合情況，并設(shè)置普通脂質(zhì)微泡組

5、及游離葉酸干預(yù)組進(jìn)行對(duì)照，評(píng)價(jià)葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡體外尋靶能力。
　　結(jié)果:卵巢癌SKOV3細(xì)胞及小鼠腹腔巨噬細(xì)胞葉酸受體免疫熒光試驗(yàn)強(qiáng)陽(yáng)性。體外尋靶顯示，葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡組見(jiàn)微泡與SKOV3細(xì)胞大量且牢固結(jié)合，普通脂質(zhì)微泡組和葉酸干預(yù)組幾乎不結(jié)合；葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡組微泡能與巨噬細(xì)胞大量結(jié)合進(jìn)而被吞噬，明顯多于普通脂質(zhì)微泡組及游離葉酸干預(yù)組。
　　結(jié)論:葉酸受體在人卵巢癌SKOV3細(xì)胞和炎癥誘

6、導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞高表達(dá)；葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡對(duì)人卵巢癌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞具備較強(qiáng)的體外靶向能力，有望成為未來(lái)卵巢癌及腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞靶向治療理想的分子探針。
　　第三部分超聲介導(dǎo)葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡對(duì)乏氧卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用及機(jī)制研究
　　目的:構(gòu)建乏氧卵巢癌 SKOV3細(xì)胞株模型，研究超聲聯(lián)合葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡對(duì)乏氧卵巢癌 SKOV3細(xì)胞的增殖抑制及凋亡誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。

7、r>　　方法:采用CoCl2化學(xué)法誘導(dǎo)構(gòu)建乏氧SKOV3細(xì)胞株，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乏氧SKOV3細(xì)胞進(jìn)行不同處理，分組如下：a.培養(yǎng)液空白對(duì)照組b.紫杉醇組、c.紫杉醇+超聲組、d.攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡組、e攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組、f.葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡組、g.葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組。應(yīng)用 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。PCR檢測(cè)乏氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子 HIF-1α和多藥耐藥基因 MDR

8、-1的表達(dá)， Western blot檢測(cè)HIF-1α蛋白和 P-gp糖蛋白的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，各處理因素對(duì)乏氧SKOV3細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)。其中，攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組及葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組對(duì)乏氧SKOV3細(xì)胞的抑制作用明顯，而葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組更為顯著，24 h,48 h和72 h分別為(64.61±12.53)%、(79.34±7.39)%及(89.83±

9、5.61)%，顯著高于同一時(shí)間點(diǎn)的其余各處理組(P<0.05),該處理組細(xì)胞凋亡率為（49.20±7.18）%，亦明顯高于其余各組（p<0.05）。PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組及葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組HIF-α及MDR-1基因及蛋白的表達(dá)有明顯下調(diào)趨勢(shì)，其中以葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組下調(diào)最為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但與攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組比較

10、，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　結(jié)論:超聲聯(lián)合葉酸靶向攜氧載紫杉醇微泡可明顯提高紫杉醇對(duì)乏氧SKOV3細(xì)胞的殺傷能力，其機(jī)制可能與下調(diào)HIF-1α及MDR-1基因及蛋白的表達(dá)，從而增加細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性有關(guān)。
　　第四部分超聲介導(dǎo)葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡對(duì)巨噬細(xì)胞殺傷作用的研究
　　目的:探討超聲聯(lián)合葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡對(duì)體外培養(yǎng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞殺傷作用。
　　方法:巰基乙酸鹽誘導(dǎo)法獲取小

11、鼠腹腔巨噬細(xì)胞，過(guò)夜孵育后，細(xì)胞分為7組：a.對(duì)照組、b.紫杉醇組、c.組紫杉醇+超聲組、d.攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡組、e.攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組、f.葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡組、g.葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡+超聲組。細(xì)胞處理后24h，MTT比色法檢測(cè)巨噬細(xì)胞的存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:各處理因素對(duì)巨噬細(xì)胞具有不同程度的殺傷作用，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸下降，其中葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡組

12、細(xì)胞的存活率降低最為顯著，24h、48h、72h分別為(49.72±4.60)%,(44.99±7.19)%和(32.17±6.73)%，明顯低于其余各處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，該組24h細(xì)胞凋亡率為（48.36±9.39）%，明顯高于其余處理組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:超聲介導(dǎo)葉酸靶向攜氧載紫杉醇脂質(zhì)微泡對(duì)巨噬細(xì)胞有一定的殺傷作用，其機(jī)制可能是葉酸受體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞特異性吞噬靶向攜氧載紫杉醇脂