ARHI基因?qū)β殉舶┘?xì)胞的作用及作用機(jī)制研究.pdf

1、研究目的:腫瘤的發(fā)生伴隨著癌基因的激活或者抑癌基因的失活,研究這些基因的功能,有助于腫瘤的靶向治療。ARHI是母源性腫瘤抑制印跡基因,在卵巢癌中失表達(dá)。本課題研究卵巢癌細(xì)胞過表達(dá)ARHI對細(xì)胞增殖的抑制作用及機(jī)制。
　　方法:本研究以質(zhì)粒pcDNA3.0-ARHI為模板PCR擴(kuò)增ARHI基因編碼序列,獲得重組質(zhì)粒所需目的基因,選用pIRES2-EGFP質(zhì)粒為載體,通過EcoRI和BamHI雙酶切及T4連接酶連接方法把擴(kuò)增的目的基因

2、插入到真核生物載體pIRES2-EGFP的MCS區(qū),兩者的粘性末端連接,并后續(xù)完成構(gòu)建后酶切、電泳及測序鑒定。QPCR法檢測不同卵巢癌細(xì)胞株中ARHI基因的表達(dá)情況,將pIRES2-EGFP-ARHI重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至 ARHI基因低表達(dá)的人卵巢癌細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn) ARHI基因表達(dá),并設(shè)立pIRES2-EGFP空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞作為對照,CCK-8法檢測pIRES2-EGFP-ARHI重組質(zhì)粒表達(dá)對轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長抑制率,流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞

3、周期分布并檢測細(xì)胞凋亡率,并用Western blotting檢測微管相關(guān)蛋白輕鏈Ⅱ(LC3-Ⅱ)、細(xì)胞內(nèi)MAPK/ERK1/2及JAK-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能蛋白P-ERK和P-STAT3的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:QPCR結(jié)果顯示所檢測卵巢癌細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的ARHI失表達(dá), SKOV3細(xì)胞在所檢測卵巢癌細(xì)胞株中ARHI表達(dá)最低。SKOV3細(xì)胞經(jīng)不同處理后,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)24h、48h、72h、96h及120h的生長抑制

4、率分別為64.69％、70.17％、67.01％、66.87％、67.70％,均明顯高于質(zhì)粒對照組(P﹤0.01)。培養(yǎng)48h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、質(zhì)粒對照組、空白對照組S期細(xì)胞的比例分別為64.18％、38.43％及15.15％;凋亡率分別為47.97％、26.53％及9.33％;培養(yǎng)72h時(shí)實(shí)驗(yàn)組、質(zhì)粒對照組、空白對照組S期細(xì)胞的比例分別為43.95％、12.37％及10.89％;凋亡率分別為51.34％、20.55％及4.39％;實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培