攜氧載ICG納米粒協(xié)同光聲動力對卵巢癌SKOV3細胞增殖抑制的實驗研究.pdf

1、第一部分攜氧載ICG納米粒制備及特性檢測
　　目的：制備攜氧液態(tài)氟碳載吲哚菁綠PLGA納米粒并進行其特性檢測
　　方法：采用雙乳化-溶劑揮發(fā)法(w/o/w)制備攜氧液態(tài)氟碳載吲哚菁綠PLGA納米粒（OPI-NPs）、載攜氧液態(tài)氟碳PLGA納米粒（OP-NPs）和載吲哚菁綠PLGA納米粒（I-NPs），光鏡下觀察形態(tài)、Malvern粒徑測定儀測定OPI-NPs的粒徑大小分布，UV-Vis分光光度計測定ICG的包封率及載藥量，光

2、聲成像儀觀察其光聲顯影能力，并與OP-NPs+free ICG及I-NPs的光聲顯影能力進行比較。
　　結果：OPI-NPs為球形，平均粒徑大?。?75.24±7.28）nm，大小分布范圍在80 nm—1000 nm之間，ICG的包封率約55%。OP-NPs+free ICG、 I-NPs及OPI-NPs的光聲顯影強度分別為0.336±0.022，0.744±0.029及1.112±0.072。OPI-NPs及I-NPs的光聲顯影

3、強度明顯強于OP-NPs+free ICG，而OPI-NPs的光聲顯影強度明顯強于I-NPs，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論：成功制備OPI-NPs納米粒，粒徑相對比較均勻，且具有良好的光聲顯影能力。
　　第二部分納米粒激發(fā)的適宜激光、超聲參數(shù)及納米粒濃度的篩選
　　目的：篩選出可以激發(fā)納米粒相變及其破裂的適宜激光及超聲參數(shù)及用于光聲動力治療的納米粒ICG濃度。
　　方法：1、激光參數(shù)篩選：將制備

4、好的納米粒稀釋20倍，按照激光強度及輻照時間分組如下：0.5W/cm2，30s、0.5W/cm2，60s、1.0 W/cm2，30s，1.0 W/cm2，60s、1.5 W/cm2，30s、1.5 W/cm2，60s、2.0 W/cm2，30s和2.0 W/cm2，60s。分別給予上述不同處理條件后，光鏡下觀察微球形態(tài)變化。2、超聲參數(shù)篩選：將制備好的納米粒稀釋20倍，激光（2.0W/cm2，30s）輻照后，根據(jù)超聲強度及輻照時間分組如

5、下：0.44 W/cm2，30s、0.44 W/cm2，60s、0.66 W/cm2，30s、0.66 W/cm2，60s、0.88 W/cm2，30s、0.88 W/cm2，60s、1.10 W/cm2，30s和1.10 W/cm2，60s。分別給予相應處理，處理后即刻光鏡觀察微球破碎情況。3、納米粒ICG濃度篩選：取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，根據(jù)納米粒中ICG的濃度分組如下：對照組、0.5μg/ml組、1.0μg/ml組、2.0μ

6、g/ml組、4.0μg/ml組和8.0μg/ml組，共6組。分別將納米粒與細胞共培養(yǎng)24h后，CCK-8檢測細胞存活率。4、適宜激光、超聲作用下對微球相變及擊碎情況觀察：，將制備好的納米粒稀釋20倍，分別取等量的納米粒懸浮液放入凝膠孔中，分別在激光（2.0W/cm2，30s）輻照前后、激光（2.0W/cm2，30s）加超聲（0.88W/cm2）輻照30秒及60秒后，診斷超聲觀察凝膠管回聲變化、光鏡觀察微球形態(tài)變化、粒徑測定儀測定微球粒徑

7、大小分布。5、適宜激光、超聲作用下對細胞增殖的影響：取對數(shù)生長期的SKOV3細胞，分組如下：對照組、激光組、超聲組及激光聯(lián)合超聲組。分別給予相應處理。應用CCK-8檢測細胞存活率，觀察各組對細胞增殖抑制情況。
　　結果：1、當激光輻照能量達到1.5W/cm2時納米粒發(fā)生明顯相變，伴隨著輻照時間的延長相變數(shù)目進一步增加，當激光能量達到2.0W/c m2時納米粒相變數(shù)目明顯增多，但隨著時間的延長，相變數(shù)目無明顯變化。2、當超聲輻照能量

8、為0.44W/cm2和0.66W/cm2時相變的納米粒未見明顯變化，伴隨著輻照時間的延長仍未見明顯的變化；當超聲輻照能量達到0.88W/ cm2時相變的納米粒數(shù)目明顯減少，伴隨著輻照能量增加到1.10W/ cm2時相變的納米粒數(shù)目減少不明顯，但隨著輻照時間的延長至60s時，相變的納米粒數(shù)目明顯減少。3、被包裹的ICG濃度0.5μg/ml至4μg/ml之間對細胞無明顯抑制作用，被包裹的ICG濃度達8μg/ml時細胞增殖明顯受到抑制。4、激

9、光激發(fā)前后的超聲顯影明顯增強，光鏡下觀察納米粒粒徑增大，納米粒平均粒徑分別為275.24nm和1533.65nm；激光輻照后再進行超聲輻照30s和60s較激光激發(fā)后的超聲顯影明顯減弱，納米粒平均粒徑分別為1060.56nm和771.38 nm。5、激光（2.0W/cm2，30s）及超聲（0.88W/cm2，60s）對細胞無明顯抑制作用。
　　結論：激光（2.0W/cm2，30s）可有效激發(fā)納米粒發(fā)生相變，超聲（0.88W/cm2，

10、60s）可有效使相變的納米粒破碎，且此能量下的超聲及激光無論單獨或聯(lián)合作用，對SKOV3細胞生長均無影響。納米粒ICG濃度≤4μg/ml對SKOV3細胞生長無抑制作用，故選擇激光（2.0W/cm2，30s）、超聲（0.88W/cm2，60s）及納米粒ICG濃度4μg/ml作為本實驗適宜參數(shù)用于后續(xù)研究中。
　　第三部分攜氧載ICG納米粒協(xié)同光聲動力對卵巢癌SKOV3細胞增殖抑制及其機制的實驗研究
　　目的：觀察光動力和聲動力

11、聯(lián)合攜氧納米粒對卵巢癌 SKOV3細胞的增殖抑制及其機制。
　　方法：1、不同處理方式對細胞生長抑制情況檢測：將對數(shù)生長期的SKOV3細胞隨機分6組： ICG+L+U組、I-NPs+L+U組、PI-NPs+L+U組、OPI-NPs+L+U組、OPI-NPs+L組和OPI-NPs+U組。分別進行相應處理，24小時后應用CCK-8檢測各組細胞存活率；2、不同的納米粒 ICG濃度對細胞生長抑制情況檢測：將不同 ICG濃度（0.25μg/

12、ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml和4.0μg/ml）的納米粒加入到對數(shù)生長期的 SKOV3細胞共培養(yǎng)24小時后，分別用激光（2.0W/cm2，30s）及超聲（0.88W/cm2，60s）處理，處理后24小時，用 CCK-8檢測細胞存活率；3、不同方式處理后無細胞體系溶液內(nèi)活性氧檢測：按照ICG終濃度為4μg/ml的各樣本加入96孔培養(yǎng)板中，然后各孔中加入濃度為50mM SOSG0.02ml，按照不同處理方式分組

13、如下：對照組、PBS+L+U組、ICG+L+U組、I-NPs+L+U組、PI-NPs+L+U組、OPI-NPs+L+U組、OPI-NPs+L組和OPI-NPs+U組；處理后20分鐘，用酶標儀測各組溶液的熒光強度；4、納米粒ICG濃度對無細胞體系溶液內(nèi)活性氧產(chǎn)生情況的影響：將不同 ICG濃度（0.25μg/ml、0.5μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml和4.0μg/ml）的納米粒分別加入到96孔板鐘，然后再加入濃度為50mM

14、SOSG0.02ml，用激光（2.0W/cm2，30s）聯(lián)合超聲（0.88W/cm2，60s）處理，處理后20分鐘，用酶標儀測溶液的熒光強度；5、不同方式處理后細胞內(nèi)活性氧檢測：將對數(shù)生長期的SKOV3細胞分8組：對照組、PBS+L+U組、ICG+L+U組、I-NPs+L+U組、PI-NPs+L+U組、OPI-NPs+L+U組、OPI-NPs+L組和OPI-NPs+U組，分別加入ICG或納米粒使溶液中的ICG濃度為4μg/ml，與SKO

15、V3細胞共培養(yǎng)24h后，分別加入2μl DCFH-DA（10mM）共培養(yǎng)20分鐘，然后用PBS沖洗3次，加入無血清培養(yǎng)液2ml，再予以激光和/或超聲進行處理，處理后20分鐘分別用流式儀檢測活性氧熒光強度及熒光顯微鏡下觀察細胞內(nèi)活性氧指示劑顯影情況。
　　結果：1、PI-NPs+L+U組,OPI-NPs+L+U組和OPI-NPs+L組對細胞的增殖抑制率分別為(30.2±1.291)%，(77.24±0.4634)%和(59.06±2

16、.003)%，明顯高于其他各處理組(P＜0.05)；OPI-NPs+L+U組和OPI-NPs+L組對細胞的增殖抑制率明顯高于PI-NPs+L+U組，OPI-NPs+L+U組對細胞的增殖抑制率明顯高于OPI-NPs+L組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。2、伴隨著納米粒ICG濃度的增大細胞增殖抑制率也隨著增加,4μg/ml組達到(72.04±5.273)%，明顯高于其他各濃度組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。3、PI-NPs+L

17、+U組, OPI-NPs+L+U組和OPI-NPs+L組無細胞體系溶液中的活性氧指示劑的熒光強度分別為185.3±19.46、440.1±11.47和355.6±31.15明顯高于其他各處理組(P＜0.05)；OPI-NPs+L+U組和OPI-NPs+L組的活性氧含量明顯高于PI-NPs+L+U組，OPI-NPs+L+U組的活性氧含量明顯高于OPI-NPs+L組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。4、伴隨著納米粒濃度增加，細胞外活性氧

18、的產(chǎn)生進一步增加,4μg/ml組達到440.1±11.47,明顯高于其他各濃度組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。5、熒光顯微鏡見PI-NPs+L+U組, OPI-NPs+L+U組和OPI-NPs+L組細胞內(nèi)均出現(xiàn)明顯綠色熒光，OPI-NPs+L+U組和OPI-NPs+L組的熒光較PI-NPs+L+U組明顯；流式儀定量檢測細胞內(nèi)活性氧指示劑熒光強度可見：PI-NPs+L+U組，OPI-NPs+L+U組和OPI-NPs+L組細胞內(nèi)活性

19、氧指示劑的熒光強度分別為1935±53.14,2939±300.2和2935±295.3，明顯高于其他各處理組，OPI-NPs+L+U組和OPI-NPs+L組細胞內(nèi)活性氧的熒光強度明顯高于PI-NPs+L+U組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而OPI-NPs+L+U組細胞內(nèi)活性氧的熒光強度與OPI-NPs+L組無明顯差異(P＞0.05)。
　　結論：激光聯(lián)合超聲激發(fā)攜氧納米粒能夠明顯抑制卵巢癌SKOV3細胞的增殖，其機制可能